АФФИННОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИОМОЛЕКУЛ: ПРИМЕНЕНИЕ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ.

© Николаев С.В.

к.м.н.

Контакт с автором: nikols2000@pochta.ru

Практически расшифрован геном человека, активно развивается протеомика, ученые все яснее представляют себе функционирование клеточных механизмов, что меняет взгляды на патогенез многих заболеваний и на стратегию синтеза лекарственных средств. Поставленные задачи предъявляют требования к техническому обеспечению исследований, стимулируют развитие новых аналитических методов.

____________________________________________________

В настоящее время в медико-биологических исследованиях используется множество способов, позволяющих выделить целевой компонент (молекулы, клетки) из сложной смеси для последующего качественного и количественного анализа. При этом такие методы часто основаны на образовании временных нековалентных химических связей между целевой молекулой и молекулой-разделителем (лигандом). Несмотря на различный генез, все такие связи (гидрофобные, диполь-дипольные, водородные, ионные) являются электростатическими по своей природе.
Биомолекулы-полимеры, в первую очередь белки, образуют указанные связи более специфично, т.к. обладают сложной пространственной структурой, что подразумевает конформационное соответствие взаимодействующих молекул. В последнем случае наблюдается так называемое аффинное взаимодействие (affinis – родственный лат.), которое, в сущности, представляет собой комбинацию электростатических и механических условий существования связи. Чем больше связей образуется, а этому должно способствовать расположение участвующих атомов, тем прочнее образовавшийся комплекс. Аффинные взаимодействия широко распространены в организме, например между медиаторами и рецепторами, антигенами и антителами, внутриклеточными белками. Примером технологии, использующей конформационно-зависимые нековалентные взаимодействия, является аффинная хроматография.

Рассмотрим в первую очередь классическую аффинную хроматографию, которая имеет препаративное значение. Аппаратно, в этом виде хроматографии используют колоночный вариант, когда стационарная фаза находится внутри полой цилиндрической трубки (колонки), а подвижная с помощью насоса и системы коммуникаций подается на ее вход. На выходе из колонки подвижная фаза содержит уже не смесь веществ, а отдельные фракции, которые собираются или анализируются в потоке различными методами.

Процесс аффинного разделения предполагает следующие стадии:

- Колонку заполняют агарозными гранулами с пришитыми к ним линкерами и лигандами
- Раствор определенной ионной силы, содержащий смесь веществ или клеток пропускают через колонку
- Происходит связывание вещество(клетка)-лиганд
- Пропускают через колонку элюент необходимой ионной силы или содержащий вещество, конкурирующее с извлекаемым компонентом за центры связывания
- Комплекс лиганд – вещество распадается и в собранной фракции элюата получаем искомое вещество или клетки

Увеличение ионной силы (концентрации соли в элюирующем буфере) обычно приводит к десорбции (смыванию) связанных компонентов с аффинных адсорбентов различных типов. Хотя в ряде случаев изменения ионной силы недостаточно для элюирования и приходится применять для десорбции специальные элюенты, например содержащие этиленгликоль.

В аналитической аффинной хроматографии происходит постоянная миниатюризация систем разделения, что, прежде всего, проявляется в уменьшении размеров колонок и диаметра частиц сорбента. Например, колонки "GSTrap 4B", в которых лигандом является глутатион, имеют объем 1 и 5 мл; ввод пробы может осуществляться как с помощью насоса, так и шприцем подходящего объема. Такой подход уменьшает разбавление анализируемой пробы, что повышает чувствительность и уменьшает расход растворителей.

Аффинную хроматографию определяет, прежде всего, высокая селективность связывания целевого вещества и лиганда, его фиксация на молекуле-разделителе, в то время как в обычной адсорбционной хроматографии практически отсутствует прочное связывание компонента с сорбентом, а если таковая присутствует, то лишь как нежелательный эффект "загрязнения колонки". Такое понятие как время удерживания, фундаментальное в адсорбционной хроматографии, вряд ли применимо, когда мы говорим о рассматриваемом методе.

В аффинной хроматографии в качестве носителя используют полимерные частицы из различных, в том числе природных материалов. В частности широко применяют специальным образом приготовленные полисахариды – агарозу, целлюлозу, декстран, а также синтетические полимеры, в частности полиакриламид. Рабочие давления в аффинной хроматографии относительно невысоки и к механическим свойствам сорбентов не предъявляют особых требований.
Классической стационарной фазой является агароза. На поверхности агарозы имеются химические группы, к которым, как и в случае адсорбционной хроматографии можно "привить", то есть ковалентно присоединить функционально активный лиганд. Для этого полисахарид, как и другие хроматографические носители, вначале подвергается так называемой активации. Уже структурированную, например виде микросфер агарозу, обрабатывают агентом, который взаимодействует с диольными группами агарозы с образованием реакционноспособной матрицы. Для этой цели в частности применяют бромоциан или хлоруксусную кислоту, в результате чего на поверхности образуется соответственно активная имидокарбонатная или карбоксильная группа. Активные группы ковалентно взаимодействуют с лигандами содержащими аминогруппы, напрямую или посредством линкера. Линкер (спейсер) представляет собой бифункциональную молекулу один участок, которой ковалентно соединен с частицей сорбента, а второй с функциональной химической группой, что помогает преодолеть стерические затруднения при взаимодействии молекула-лиганд.

Аффинная хроматография не всегда применяется изолированно. Иногда для большей эффективности комбинируют несколько разных по механизму колонок в одной системе, Например новая автоматизированная система жидкостной хроматографии "ÄKTAxpress" фирмы "Amersham Biosciences" может очищать белки в последовательно соединенном комплексе колонок, работающих по механизму аффинной, эксклюзионной (гель-фильтрация) и ионообменной хроматографии.

С другой стороны, появляются современные альтернативы колонкам с наполнителем пригодные для аффинных приложений, такие как монолитные CIM (Convective Interaction Media) колонки (диски), получаемые сополимеризаицей глицидилметакрилата и этилендиметакрилата (GMA-EDMA), а также более структурированные колонки, имеющие структуру чипа с упорядоченным ветвлением микроканалов.


Проточные методы аффинного разделения постоянно совершенствуются, меняется их формат. В микроаналитических системах часто используется параллельный способ разделения. Так, фирма "3M Bioanalytical Technologies" разработала набор "Empore™ Affinity Az" в планшетном 96-луночном варианте. Набор предназначен для разделения и очистки белков, оригинальная технология использует мембраны, активированные azlactone функциональными группами. Выбранный лиганд-разделитель реагирует своими аминогруппами с активированной мембранной, образуя прочные ковалентные связи. Затем проба разделяемых веществ вносится в лунку, со встроенной мембраной, на которой ковалентно закреплен лиганд-разделитель. Скорость процесса разделения обеспечивается параллельным приложением вакуума к лункам (manifold) или центрифугированием планшета.

Другой in-flow способ (технология xMAP™), обладающий впечатляющей аналитической способностью предложила фирма "Luminex". В этой мультипараллельной методике каждая микрочастица, обладает уникальным цветом и несет на себе определенный лиганд, например антитело к какому-то белку. Один оттенок цвета частицы кодирует ее номер, другой – количество специфически связавшегося материала. Вначале до сотни уникальных микрочастиц просто смешиваются с биоматериалом, например лизатом клеток. Затем используется проточный сортировщик частиц детектирующий цвет каждой. Кроме разделения сложных смесей полученных из биологических объектов, например белков, метод, по-видимому, применим и для разделения продуктов параллельных синтезов в комбинаторной химии.

Кроме классического варианта колоночной хроматографии активно развиваются другие технологии основанные на аффинном взаимодействии. К таковым можно отнести MACS (Magnet Associated Cell Sorting). В данном batch-методе (сорбция в статических условиях), который применяется для разделения клеточного материала, антитела к специфическим молекулам клеточной поверхности ковалентно связаны с полимерными сферическими гранулами, содержащими в центре ферромагнетик. После связывания антител со специфической клеточной популяцией, гранулы и связанные с ними клетки отделяются от общей клеточной массы магнитным полем.

Распространенным методом исследования с применением аффинных взаимодействий является иммунно-ферментный анализ (ИФА). В принципе применение антител как молекул-разделителей более чем характерно и для колоночной аффинной хроматографии. Но ИФА не применяется для разделения веществ, его основная задача аналитическая, а именно тонкий количественный анализ. Основа метода – специфическое взаимодействие меченого антитела с измеряемым антигеном (возможно наоборот), за которым следует определение концентрации образовавшихся комплексов или непрореагировавших компонентов. Почему в качестве метки выбран фермент, а не изотоп или флуорофор? Дело в том, что мы здесь сталкиваемся с системой химического усиления сигнала. Такие системы на несколько порядков повышают чувствительность обнаружения молекул, потому что фермент (в данном случае) способен перевести в активную, доступную для детекции форму множество молекул субстрата. Все варианты ИФА (а их существует множество), можно разделить на гомогенные и гетерогенные. Лидирующее место сейчас занимают гетерогенные методы ИФА, когда один из лигандов закреплен на твердом субстрате.

Аффинные взаимодействия молекул сами по себе являются объектом изучения. При этом используется множество методов. В последнее время ведущее место принадлежит спектроскопии плазмонного резонанса. Преимущество метода - измерение молекулярных взаимодействий в реальном времени. Популярный инструмент – "BIAcore 1000".

Оригинальный способ изучения аффинных взаимодействий, не требующей сложной дорогостоящей аппаратуры предложили исследователи UC Berkeley. Суть технологии заключается в использовании коллоидного раствора микрочастиц, покрытых оболочкой, напоминающей мембрану живой клетки. Рецепторы или другие молекулы, взаимодействие которых необходимо выяснить, встраивают в оболочку. Состав раствора подбирают так, что в обычных условиях частицы образуют энергетически неустойчивые микроагрегаты. Достаточно небольшого изменения в энергетическом состоянии системы, например связывания молекулы с лигандом, чтобы микроагрегаты распались. Процесс можно наблюдать в обычный световой микроскоп.

Несколько слов о роли аффинных технологий в фармакологии. В последнее время в процессе дизайна лекарственных средств произошел переворот. Раньше отдельно синтезировали каждое химическое соединение и пытались обнаружить у него терапевтический потенциал на модели патологического состояния. Теперь фармакологи следуют от обратного, используя данные о функциональном значении макромолекулы (протеина) в физиологии и патофизиологии клетки, они подбирают лиганд, уже существующий или синтезируемый методом комбинаторной химии, который будет нужным образом влиять на ведущее звено заболевания. Разработаны и активно используются тест-системы, в которых автоматически и параллельно исследуют аффинное связывание многих молекул-мишеней (например группы рецепторов клеточной поверхности) со смесями химических низкомолекулярных соединений полученных комбинаторно или из химического архива (библиотеки). Микрожидкостная система "LabChip" фирмы "Caliper" является подобным инструментом масштабного тестирования перспективных для фармакологии химических соединений.

Лекарственное средство при попадании в организм вступает с ним в сложные взаимодействия, что определяет в частности фармакокинетику препарата. Аффинные взаимодействия имеют место и в этом случае, в частности при связывании лекарственных средств с белками плазмы. Основное значение здесь принадлежит альбумину. Лекарственные вещества со сходной конформационной структурой могут связываться с одними и теми же центрами на альбумине: так, кампотехин может замещаться бутадионом, но не будет замещаться дикумарином.

Возвращаясь к вопросу о конформационном соответствии, следует учитывать, что оно является значимым не только для взаимодействия молекула-молекула. Рассмотрим для примера адсорбционную жидкостную хроматографию на обращенных фазах. Так, в сорбенте "Hisep" малый размер гидрофобных пор наряду с гидрофильным покрытием поверхности гранул однозначно исключает крупномолекулярный компонент (белок) из процесса разделения. Молекулы белка просто не могут проникнуть в поры, с гидрофобным компонентом пор взаимодействуют только малые молекулы, а в целом гидрофильная поверхность гранулы отталкивает большинство белков. Поэтому в колонку можно вводить предварительно неочищенный от белков материал, не опасаясь ее загрязнения. В тоже время, в эксклюзионной (гель-фильтрация) хроматографии размер пор сорбента контролируется особо тщательно и является ведущим фактором, определяющим успешное разделение смеси.
Таким образом, говоря об аффинном механизме, не стоит ли рассматривать его несколько шире, не просто как конкретное взаимодействие белок-лиганд, но как сумму электростатического и конформационного соответствия? Конфигурация пор используемых хроматографических сорбентов разумеется неспецифична. Но активно разрабатываемые в последнее время молекулярно отпечатанные полимеры (molecularly imprinted polymers – MIPs), обладают уникальной селективностью при связывании с молекулой-шаблоном, в том числе за счет соответствующей конфигурации пор поверхности.


Использованы материалы журнала “The Scientist” (www.the-scientist.com)
 

Защита интеллектуальной собственности и авторских прав Диспуты по темам изобретательства. Вопросы по изобретениям, проблемы на пути изобретателей и методы их решения. Патентование. Все о патентовании изобретений, полезных моделей, промышленных образцов и товарных знаков. Нерешенные задачи. Здесь идет обсуждение нерешенных задач: безопорный двигатель, вечный двигатель, преодоление гравитации и пр. Точные науки и дисциплины Дебаты по Теории Относительности Эйнштейна. Все кому не лень хотят опровергнуть Теорию Относительности Эйнштейна. Вам предоставляется слово для аргументации. Физика, астрономия, математические решения. Физико-математические вопросы, наблюдения, исследования, теории и их решение. Физика альтернативная. Новые взгляды на физические законы, теории, эксперименты, не вписывающиеся в общепринятые законы физики. Teхника, узлы, механизмы, электроника и аппаратура. Все про технику, приборы, детали, узлы и механизмы. Электроника, компьютеры, программное обеспечение. Новые технические решения в самых разных областях. Биология, Генетика, Все о жизни. Генетика и другие вопросы биологии. Их развитие. Медицина. Биотехнологии, агротехника и сельское хозяйство. Эволюционные теории и альтернативные им. Химия. Вопросы по химическим технологиям, разработкам и применению химических материалов. Химические элементы и их свойства. Геология, все о Земле и ее обитателях. Геология, метеорология, антропология, сейсмология, атмосферные явления и непознанные эффекты природы. Мозговой штурм Генератор решений. Здесь Вы можете заработать реальные деньги, помогая решать фирмам, предприятиям и частным лицам те или иные технические задачи, которые перед ними стоят. Те, кто ставят задачи перед участниками должны обозначить гонорар за ее решение и перевести указанную сумму на общий счет генератора. Головоломки. Если у Вас есть желание поломать голову над интересными логическими задачами - Вам сюда. Гипотезы. В этой теме идет обсуждение гипотез и предположений, основанных чисто на теории и логике. Найди ляп! Этот раздел для тех, кто хочет мысленно расслабиться. Он посвящен задачам по поискам ляпов, которые встречаются в литературе, интернете, кино и на телевидении. Взгляд в будущее и настоящее Глобальные темы. Вопросы касающиеся всех. Глобальные угрозы и злободневные темы современности. Наука и ее развитие. Все о развитии науки, направлениях и перспективах движения научной мысли и знаний. Новая Цивилизация. Принципы социального устройства новой цивилизации. Увеличение роли созидательного интеллекта... Отдалённые перспективы развития человечества... Вопросы без ответов. Этот раздел посвящен вопросам и проблемам, которые до сих пор не решены. Предлагайте свои решения. Военная стратегия и тактика современных боевых действий. Об особенностях современного военного искусства. Проблемные вопросы теории и практики подготовки вооруженных сил к войне, её планирование и ведение в различных конфликтах на планете. Гуманитарные науки и дисциплины Философские дискуссии. Диспуты по вопросам жизни, сознания, бытия и иных философских понятий. Экономика. Вопросы по экономике и о путях развития России и других стран. Социология, Политология, Психология. В этом разделе обсуждаются вопросы, как отдельных частных исследований данных наук, так и проблема соотношения этих наук с остальными. Образование. Все об образовании: как учить, кому учить, чему учить и кого учить. Религия и атеизм. Вопросы религий и атеистические взгляды, религиозные споры.

Назад