СТАТЬИ И ПУБЛИКАЦИИ

Вход или Регистрация

ПОМОЩЬ В ПАТЕНТОВАНИИ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ФОРУМ Научно-техническая библиотекаНаучно-техническая библиотека SciTecLibrary
 
Cтатьи и Публикации    Биофизика МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

ВВЕДЕНИЕ В КВАНТОВУЮ ФОНОННУЮ БИОЛОГИЮ МЕМБРАН.

© С.Н. Семёнов

Контакт с автором: margys@softel.ru

Биологические мембраны являются одной из важнейших клеточных структур. Не смотря на многообразие выполняемых операций, мембраны характеризуются общими структурными и функциональными чертами. В настоящее время существует ряд различных моделей строения и функционирования биомембран. Все они базируются на ставшей уже классической Мозаичной структуре биомембран. В данной серии работ предложена ещё одна – “Молекулярно-механическая модель строения и функционирования биологических мембран”.

Основное достоинство предложенной “Молекулярно-механическая модели строения и функционирования биологических мембран” (в дальнейшем – Модели) заключается в том, что она позволяет описывать широкий спектр различных явлений. Всё это удалось сделать без привлечения каких-либо специфических допущений, а только в рамках современной молекулярной физики не только качественно, но и количественно.

В рамках Модели естественно описывается влияние липидов на структуру и функционирование проникающих мембранных белков, нарушение структуры и функционирования биомембран под действием посторонних агентов и т.д. В частности, становится ясной необходимость “жидкой” липидной фазы, роль липида в передаче межмолекулярной и трансмембранной информации и путей разделения её потоков, механизм автоматического демпфирования внешних и внутри мембранных воздействий и возмущений.

В настоящее время нельзя утверждать, что предложенная Модель является полностью законченной и универсальной, что она применима во всех случаях. Естественно, что по мере накопления новых экспериментальных фактов, в неё могут вноситься дополнения и уточнения. Особенно это касается “неклассических” разделов Модели.

Кроме того, специальных исследований требует определение возможности применения Модели для вирусов, содержащих липидные оболочки (суперкапсиды) и, быть может, для иных липосодержащих вирусов. К ним относятся многие ДНК-содержащие вирусы, например, вирусов группы оспы (variola) и гепреса (herpes), а также, практически, все крупные РНК-содержащие вирусы, за исключением реовирусов. Хотя достаточно высокое содержание липидов, около 25 % от веса сухого вируса, сравнимое с содержанием липидов в плазматической мембране клеток, позволяет надеяться на успешное решение данного вопроса.

Кратко можно сказать, что биомембрана это не только граница разных сред, т.е. каждый монослой является только частичной границей. А сама Биомембрана – граница, разделяющая живое и неживое. По одну её сторону живая клетка, по – другую – неживая природа, т.е., биомембрана расположена где-то между живым и неживым.

В представленных работах кратко изложены основные понятия и физические параметры, используемые при описании Модели. (В работах приведены только те собственные экспериментальные данные, которые иллюстрируют использование упомянутых выше параметров биомембран, и которые не публиковались ранее.) Эти понятия необходимы для понимания полученных выводов, позволяющих описывать свойства мембран различных клеток, находящихся в разных фазах своего жизненного цикла. Полученные в рамках Модели, выводы и их экспериментальная проверка были использованы в серии изобретений, находящихся сейчас в процессе патентования (РСТ/CZ01/00046 от 26.08.2001). В представленной заявке предложены методы идентификации и/или селективного воздействия на выбранные клетки в различных клеточных системах. Эти методы позволяют не только идентифицировать отдельные виды клеток в различных клеточных системах, но и определять фазы клеточного жизненного цикла. Затем, при необходимости, селективно воздействовать на выбранные клетки бесконтактными методами.

Теор. обоснование Авторского свидетельства SU 1465768 A1 “СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ДАВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН”, 23.06.86, С.Н. Семёнов и Н.И. Королёв.

С.Н. Семёнов

Проведенное ранее изучение ряда соединений на границе раздела фаз показало, что движущей силой, вызывающей конформационные и агрегационные перестройки в пептидных цепях является латеральное давление в монослое (1 – 5, след. статьи данной серии). Иными словами, изменения конформации и/или агрегации полипептидов обусловлено механическим давлением, действующим на молекулу со стороны окружающего её монослоя.

Из термодинамики следует (6, 7), что при нанесении поверхностно-активного вещества на границу раздела фаз, её свободная энергия понижается. Измеряемая в опыте величина поверхностного давления (ΔР) представляет собой уменьшение свободной энергии F) единицы площади поверхности.

Таким образом:

ΔР = γ – γ’ = -ΔF

где γ – поверхностное натяжение чистого раствора;

γ’ – поверхностное натяжение раствора с монослоем на его поверхности.

Известно, что состояние равновесия незамкнутой системы при постоянной температуре и объёме (площади) отвечает минимум свободной энергии. Поверхность раздела фаз представляет пример такой системы, поэтому более поверхностно-активное вещество вытесняет с границы раздела фаз вода-воздух менее поверхностно-активное вещество. В системе, содержащей несколько невзаимодействующих поверхностно-активных компонент, максимальное поверхностное давление не может превышать величины равновесного поверхностного давления (поверхностного давления коллапса монослоя) наиболее поверхностно-активного соединения. (Эффект полислойной адсорбции на границе раздела фаз не учитывается, хотя и может приводить к небольшому увеличению давления.) Невыполнение данного условия указывает на взаимодействие частиц либо в монослое, либо в монослое и подстилающем растворе, как это наблюдалось при адсорбции исследованных пептидов на фосфолипидных монослоях. Этим и было обусловлено введение понятие пептид-липидного комплекса.

Образовавшиеся пептид-липидные комплексы можно рассматривать как новый неионный поверхностно-активный компонент монослоя. Экспериментальные данные указывают, что внедрение комплексов в монослой сопровождается увеличением его поверхностного давления до величин, не превышающих давления коллапсов соответствующих пептид-липидных комплексов. Следовательно, пептид-липидные комплексы и окружающие их липидные молекулы можно рассматривать как невзаимодействующие между собой частицы, т.е. энергия любых других взаимодействий между компонентами монослоя, за исключением взаимодействия с подстилающим раствором и теплового движения на поверхности, обуславливающих наличие поверхностного давления в монослое, равна 0. Корректнее говорить, что все другие взаимодействия между частицами в монослое малы по сравнению с kT, где k - константа Больцмана, Т – абсолютная температура в градусах Кельвина.

Для смешанного монослоя, состоящего из фосфолипида и пептид-липидных комплексов, можно написать следующую систему уравнений:

Sп – Sк`Nк = Sл(`Nл - λ`Nк)

Sп – Sк``Nк = Sл(``Nл – λ``Nк)

где: Sп - площадь поверхности раздела фаз вода-воздух;

Nл - первоначальное количество молекул липида на поверхности;

Sл площадь, занимаемая одной молекулой липида на поверхности;

Nкколичество полипептидных молекул, внесённых в раствор;

Sк - площадь, занимаемая одним пептид-липидным комплексом на поверхности;

λ - коэффициент, показывающий, сколько липидных молекул приходится на одну полипептидную молекулу в комплексе.

Для решения системы уравнений Nл и Nк берутся из разных кривых титрования при одинаковом поверхностном давлении. Для грамицидина S, когда λ = 2, найденные из уравнений площади, приходящиеся на молекулу фосфатидной кислоты в монослое, совпадают со значениями, полученными при сжатии монослоёв чистого фосфолипида. Среднее квадратичное отклонение между полученными при решении, приведённой выше системы уравнений, и экспериментально измеренными значениями площадей не превышали 6 Ǻ2, т.е. лежали в пределах ошибки опыта. Совпадение площадей также подтверждает сделанный выше вывод, что на границе раздела фаз можно рассматривать фосфолипид и комплексы как невзаимодействующие между собой частицы. В противном случае, если бы между частицами в монослое было притяжение или отталкивание (любое специфическое взаимодействие, не зависимо от его физической природы), то эффективная (кажущаяся) площадь, приходящаяся на молекулу вещества, была, соответственно, либо больше, либо меньше той, которая измерена для чистого соединения. Система уравнений была использована, как ещё один независимый способ, показать, что пептид-липидные комплексы и фосфолипид можно рассматривать в виде невзаимодействующих между собой молекул (невзаимодействующие в том смысле, как это было определено выше).

Прямое измерение свободной энергии при взаимодействии катионных полипептидов с фосфолипидными монослоями и приведённые выше решения системы уравнений однозначно указывают, что многократные попытки объяснить деструктурирующее влияние этих соединений на мембраны, с помощью липид-белковых гидрофобных взаимодействий не имеют под собой реальной почвы. Тем более что, по сути, гидрофобные взаимодействия это некий процесс, уменьшающий энтропийный член свободной энергии системы. Это происходит при взаимодействии ряда молекул (называемых гидрофобными) с водным окружением, что, вообще говоря, полностью соответствует их названию. (Наличие у молекул “нелюбви” к чему-либо ещё абсолютно не означает их “сильной любви” к чему-то другому.)

Гидрофобные взаимодействия обуславливают само ассоциацию молекул, их стремление избежать контакта с водой, что приводит к их выходу на границу раздела полярной и неполярной фаз, в том числе и встраивание в мембраны. Иначе говоря, эти взаимодействия ответственны за поверхностную активность молекул, их способность переходить из одной фазы в другую, включая и их границу.

Нужно отметить, что понятие “гидрофобный/гидрофильный” имеет смысл только для достаточно больших систем, когда уже вступают в силу статистические закономерности, и теряют смысл при рассмотрении отдельных молекул. Корректнее, это энтропийный вклад в свободную энергию системы, указывающий на вероятность существования того или иного состояния в огромной системе.

Связь поверхностной активности пептид-липидных комплексов с их деструктурирующим действием на мембраны.

Существует несколько полуэмпирических теорий взаимодействия липидных молекул в бислоях, основы которых были заложены ранее (8 – 10). Полученные результаты говорят, что наличие невзаимодействующих с липидом молекул должно уменьшать прочность мембран (11 – 13) за счёт образования структурных дефектов. Поэтому разумно предположить, что достижение некоторой поверхностной плотности дефектов (N) в бислойной части мембраны приводит к разрушению последней. Выше показано, что пептид-липидные комплексы не взаимодействуют в мембране с окружавшим фосфолипидом и, следовательно, их можно рассматривать как зародыши дефектов в структуре липидного бислоя.

Пептид-липидные комплексы названы зародышами дефектов потому, что возмущения, вызываемые внедрением чужеродных (не липидных) молекул, захватывают обычно не только ближайших соседей (14).

Оценим вероятность образования таких дефектов мембране, рассматривая образование и/или внедрение пептид-липидных комплексов в бислойные участки биомембран, как возникновение дефектов её структуры.

Очевидно, что вероятность образования N дефектов в мембране пропорциональна образованию одного дефекта для невзаимодействующих (независимых) дефектов.

Пусть F(P,T) – свободная энергия единицы поверхности липидного бислоя биомембраны;

Еп – поверхностная энергия пептид-липдного комплекса.

Тогда вероятность Wп) образования дефектов в мембране будет равна вероятности образования, за счёт флуктуаций плотности упаковки липидных молекул (15), участков в мембране с энергией, не превышающей Еп. Таким образом, искомая вероятность пропорциональна:

Wп) ~ exp [F(P,T) – Еп] / kT (1)

С учётом того, что:

Fп = Еп – ТSп (2)

где: Fп - свободная поверхностная энергия комплексов;

Sпповерхностная энтропия комплексов.

Формулу 1 можно переписать в следующем виде:

Wп) ~ exp[F(P,T) – Fп – ТSп]/kТ (3)

Очевидно, что для невзаимодействующих, хаотически распределённых дефектов, образованных пептид-липидными комплексами, ехр –(ТSп/kТ) представляет собой постоянный сомножитель и его можно опустить. (Постоянный сомножитель на пропорциональность не влияет.) Тогда формулу 3 можно переписать в виде:

W(Eп) ~ ехр [F(P,T)/kT] exp-(Fп/kТ) (4)

Обе стороны уравнения 4 умножим на 1, но для левой части уравнения 1 представим в виде: 1 = ехр(Fв – Fв)/kТ, где Fв свободная энергия границы раздела фаз вода/воздух. Тогда, с учётом самого первого уравнения, приведённого в начале работы, для связи свободной энергии и поверхностного давления получим:

Wп) ~ ехр(ΔРк/kT) exp(ΔРм/kТ) (5)

где ΔРм поверхностное давление мембраны;

ΔРк - поверхностное давление пептид-липидного комплекса.

При выводе формулы подразумевалось, что поверхностное давление мембраны больше поверхностного давления образования и равновесного существования на границе раздела фаз дефектообразующих частиц. Иначе, все частицы могут образовать структурные дефекты в такой мембране. Вопрос в том, что произойдёт быстрее - или мембрана разрушится, если частиц много и для нарушения нормального функционирования системы достаточно части из них, или они все встроятся в мембрану, но их число будет меньше некоторого порогового, критического значения и их влияние можно будет и не заметить.

Таким образом, получено, что при действии различных соединений на одну и туже мембрану, их эффективность экспоненциально возрастает с ростом их поверхностной активности. А при действии одного вещества на разные мембраны – экспоненциально падает при росте поверхностного давления мембраны, т.е. резко зависит от плотности упаковки липидных, да и не только липидных молекул.

Пептид-липидные комплексы грамицидина S и его аналогов с фосфолипидами обладали разными значениями предельного поверхностного давления (2) на границе раздела фаз и разной биологической активностью. Образуемые ими липидные комплексы, как показано выше, обладали свойствами, присущими дефектообразующим частицам на границе мембрана/омывающий раствор. Следовательно, при действии на биологические мембраны, поверхностное давление которых близко к давлению коллапса комплексов грамицидина S с фосфолипидом, лизирующая способность природного антибиотика должна быть в, примерно, 44 раза выше, чем у его “полностью L” аналога т.к. ехр (34,0/9,0) = 43,7. Такому условию удовлетворяют мембраны эритроцитов человека, поверхностное давление которых лежит в пределах 31 – 35 дин/см (16). Поэтому, отношение гемолитических активностей указанных соединений или, что то же самое, скорость лизиса эритроцитов, должна быть близка к теоретически ожидаемой величине. Экспериментальная проверка этого предположения была проведена в ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР. Получено, что скорость гемолиза эритроцитов человека (а именно автора) в физиологическом растворе в присутствии грамицидина S в 44 раза выше, чем в присутствии его ретро- или “полностью L” аналогов. Поверхностные давления и площади комплексов этих соединение с фосфолипидом были практически равны.

Очевидно, что получено не просто хорошее совпадение, а очень хорошее совпадение теоретических и экспериментальных значений отношения биологических активностей мембрано-активных соединений. Это говорит, что начальные предположения и последующие выводы являются справедливыми.

Не сложно получить и остальные формулы, приведённые в авторском свидетельстве для определения поверхностного давления биологических мембран, основанные на сравнении биологических активностей грамицидина S и его “полностью L” аналога. (Ретро-грамицидин S для этих целей мене пригоден, т.к. коллапс его комплексов с фосфолипидом менее ярко выражен, чем его “полностью L” аналог.)

{Данный вывод легко распространить и на другие классы мембрано-активных соединений, биологическая активность которых контролируется процессом их проникновения в углеводородную – гидрофобную – область различных мембран, например, тех же фосфолипаз. Если можно наблюдать биологический эффект при малых воздействиях (малых концентрациях) активных молекул, то их взаимовлиянием, скорее всего, можно пренебрегать. Кстати, для поверхностно активных соединений, это может быть и обратным тестом – типа, определения лимитирующей стадии реакции.)

Так как силы сцепления (скорее энергия образования/взаимодействия?) между липидными молекулами зависят от расстояния между ними и пропорциональны поверхностной плотности частиц (8), то в первом приближении разумно предполагать, что лизирующая активность дефекта пропорциональна его площади. (А как пропорциональна – надо подумать.) Таким образом, в формуле 5 появляется новый сомножитель, зависящий от поверхностной площади дефекта.

Изучение электрического пробоя бислойных липидных мембран показало, что разрушение мембран наступает при достижении дефектом некоего критического размера (17 – 20). Разумно предположить наличие аналогичных критических размеров и для биомембран. При достижении дефектом критического размера его деструктурирующая активность больше не будет завесить от размера на границе раздела фаз. (Размер дефекта может быть больше или равен размеру вызывающей его частицы.) Вообще говоря, надо учитывать некоторую эффективную площадь мембранного дефекта.

При действии на митохондрии крыс мелиттин (о нём речь будет идти ниже) был в 4 раза активнее грамицидина S. Мелиттин основной литический компонент пчелиного яда. В водных растворах он обнаружен в агрегированном состоянии в виде тетрамеров. На границе раздела фаз, при сжатии и при взаимодействии с фосфолипидом распадается на мономеры. Его комплексы с фосфолипидом могут содержать до 5 молекул последнего. Такие “насыщенные” комплексы обладают площадью в 2,5 раза больше, чем липид-грамицидиновые, но поверхностные давления коллапсов у них были равны. (5) В этих экспериментах поверхностные давления мембран и комплексов “насыщенных” были равны, отличались только площади, приходящиеся на 1 комплекс в монослое. И, быть может, не все комплексы мелиттина с фосфолипидом были “насыщенными”.

Таким образом, полученные результаты указывают, что активным началом является не сам катионный детергент, а его комплекс с молекулами фосфолипида, входящими в состав мембраны. Детергентом уже является пептид-липидный комплекс, который является неионным детергентом. Следовательно, деление детергентов на ионные и неионные не имеет под собой реального основания. При таком деления между собой сравниваются реальное, действующее начало, действующее на структуру мембраны и “полуфабрикат”. Этот “полуфабрикат” становится действующим агентов только после образования комплекса с липидом. При этом, площадь комплекса в мембране больше, чем у исходного “полуфабриката” и, следовательно, его активность выше.

В заключение следует отметить, что, так как существует не обязательно линейная зависимость между мембранной активностью соединения и его площадью на границе раздела фаз, то в заявке и введено требование наличия у молекул одинаковых площадей.

Лизис мембраны – это крайняя стадия действия вещества на мембрану. В малых концентрациях они могут вызывать не лизис, а иные нарушения функционирования мембранных систем. Поэтому, в заявку и включено требование – наблюдать и регистрировать любой вид биологической активности и/или её изменения, вызванные действием мембрано-активных соединений на биологические мембраны.

Ниже приведены значения поверхностного давления ряда биологических мембран, полученные с помощью описанного выше способа (22);

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Staphylococcus aureus и Sareina letea равны 55,0 ± 5,0 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Bac. subtilis равно 20 – 25 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран E. coli равно 20 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Mycob. phlei. равно 15 – 20 дин/см.

Поверхностное давление мембран бактериородопсиновых бляшек Halobacteriuv halobium равно 34,5 ± 0,5 дин/см.

Метод пригоден не только для мембран прокариотов, но и для эукариотов. Величина латерального поверхностного давления мембран эритроцитов человека равно 34,5 ± 0,5 дин/см, а внешних мембран митохондрий печени крыс – 21,0 ± 0,5 дин/см.

Дополнение № 1.

СКАЧОК ПОВЕРХНОСТНОГО ПОТЕНЦИАЛА монослоёв липид – грамицидинового комплекса, равный 700 ± 20 мВ, в коллапсе меньше, чем у самого грамицидина S на величину скачка потенциала монослоёв фосфатидной кислоты (200 ± 20 мВ), при площадях, занимаемых молекулой фосфолипида близкой к тем, что характерны для различных мембран. (Для плотно упакованных монослоёв.)

Так как вертикальная составляющая дипольного момента липид – пептидного комплекса, примерно, равна разности между дипольными моментами антибиотика и вертикальными составляющими 2-х молекул липида, то наиболее простым объяснением экспериментальных фактов является предположение, что внедрение грамицидина S в монослой и образование комплекса сопровождается переориентацией молекул фосфолипида, связанных с антибиотиком. Видно, что такая переориентация липида возможна при поверхностных давлениях монослоя выше, примерно, 25 дин/см. Очевидно, что при такой структуре липид – пептидного комплекса его поверхностно-активные свойства будут подобны свойствам электронейтрального аналога грамицидина S – N,N’-диацетил грамицидина S.

Дополнение № 2.

В зависимости от знака разности между поверхностным давлением коллапса монослоя деструктурирующего агента и поверхностного давления мембраны могут наблюдаться различные зависимости действия агента от температуры. Если поверхностное давление агента превышает поверхностное давление мембраны, то его биологическое действие, как это следует из полученных уравнений, будет увеличиваться при понижении температуры. Это, вероятно, и наблюдается при действии грамицидина S на мембраны протопластов Micrococcus lysodeikticus (23). В противном случае биологическая активность агента будет падать при повышении температуры. Иными словами, для объяснения температурных зависимостей литического действия детергентов нет необходимости искать какие-то специфические взаимодействия меду деструктурирующим агентом и компонентами биомембран, как это часто делается. А различия в температурных зависимостях действия одного и того же соединения на мембраны различных клеток обусловлены только различиями в поверхностном давлении последних.

Полученные результаты указывают, что возможен целенаправленный подбор поверхностно-активных агентов, действующих на определённые клетки, в том числе и на микроорганизмы. При этом обязательно необходимо учитывать и поверхностное давление мембраны – мишени. От соотношения между указанными выше величинами и зависит эффективность действия лизирующего агента на конкретную клетку при разных температурах.

В заключение данного раздела необходимо отметить, что встраивание инородных частиц в мембрану, взаимодействие которых с липидом слабее взаимодействия липидных молекул между собой, приводит к возникновению структурных дефектов. Следовательно, для появления структурного дефекта необходимо ослабить взаимодействие компонент мембраны между собой в какой-либо её точке. Очевидно, что кроме введения инородных, поверхностно-активных веществ, которые плохо взаимодействуют с мембранными компонентами, существуют и иные пути. Например, модификация отдельных мембранных компонент таким образом, что бы они теряли свои поверхностно-активные свойства и выталкивались с границы раздела фаз за счёт наличия у самой мембраны поверхностно-ак- тивных свойств. Кроме того, возможно, добавляя гидрофильные группы к гидрофобным участкам мембранных белков и/или углеводородным цепям липидов, уменьшить свободную энергию межмолекулярных взаимодействий в гидрофобной области мембраны. При этом может возрастать площадь модифицированной молекулы, что также будет приводить к увеличению её деструктивных свойств. Третий путь, приводящий к ослаблению межмолекулярных взаимодействий в бислойных липидных участках мембран – образование лизолипидов. Т.е. механизм действия лизолипидов заключается в том, что отсутствие углеводородной цепи в молекуле фосфолипида (иначе – уменьшение плотности углеводородных цепей в мембране) приводит к уменьшению межмолекулярных взаимодействий и увеличению подвижности мембранных молекул, составляющих окружение лизолипида, и образованию структурного дефекта.

Таким образом, дан анализ связи литической активности агентов, вызывающих нарушения структуры мембраны, с их свойствами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Показана важность знания поверхностного давления биологических мембран – мишени для понимания особенностей действия деструктурирующих агентов. Кратко указаны возможные пути модификации мембранных компонентов, приводящие к нарушению свойств и нормального функционирования биомембран.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

  1. Взаимодействие кардиотоксина из яда кобры NAJA NAJA OXIANA с модельными фосфолипидными мембранами. Ксенжек О.С., Гевод В.С., Омельченко А.М., Семёнов С.Н., Сотниченко А.И., Мирошников А.И., “Молек. биол.”, (1978), 12, №5, 1057 – 1065.
  2. Изучение взаимодействия грамицидина S с модельными липидными системами. Семёнов С.Н., Мельник Е.И., Снежкова Л.Г., Мирошников А.И., Иванов В.Т., “Биоорган. хим.”, (1978), 3, №8, 1055 – 1063.
  3. The Molecular Mechanism of the Interaction of Gramicidin S and Phospholipid Monolayers. E.I. Melnik, S.N. Semenov, and A.I. Miroshnikov, “Membrane Transport Processes”, vol. 2, edit. D.C. Tosteson, Yu.A. Ovchinnikov and R.Latore, Raven Press, N.Y., 1978, pp. 261 – 266.
  4. Mechanistic Studies of Gramicidin S. S.N. Semenov, L.G.Snezhkova, A.I.Miroshni-kov, V.Т.Ivanov, Yu.A.Ovchinnikov, Abstracts of Soviet – French Symp. on the Phys. Chem. of Proteins and Peptides, Sep. 9 –12, 1975, pp. 28 – 29.
  5. Связь между структурой и биол. действием поверхностно-активных полипептидов. А.И. Мирошников, С.Н. Семёнов, Л.Г. Снежкова, А.И. Сотниченко, В.Т. Иванов, Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума “Физиологическая роль поверхностно-активных веществ”, Черновцы, 1975, стр. 69 – 70.
  6. Статистическая физика, Л.Д. Ландау, Е.М. Лифшиц, (1964), М., “Наука”, 536 – 542.
  7. Курс теор. физики. И.Г. Левич, (1969), М., “Наука”, т. 1, стр. 621 – 625.
  8. Theory of Orientation Order in Chain Molecules. Phase Transition in n-Alkanes and Lipid Membranes. Kimura H., Nakano H., “J. Phys. Soc. Japan”, (1977), vol.43, No 5, pp. 1477 – 1484.
  9. Molecular Theory of Lipid Membrane Order. Jдhnig F., “J. Chem. Phys.”, (1979), vol.70, No 7, pp. 3279 – 3290.
  10. A Theoretical Model for Lipid Mixtures, Phase transitions and Phase Diagrams. Scott H.L., Cheng Wood-Hi, “Biophys. J.” (1979), 28, pp.117 – 132.
  11. A Statistical Mechanical Model of the Lipid Bilayer Above its Phase Transition. Gruen D.W.R., “Biochim. Biophys. Acta”, (1980), 595, 161 – 183.
  12. Chain Ordering in Liquid Crystals. II. Structure of Bilayer Membranes, S. Marčelja, “Biochim. Biophys. Acta”, (1974), 367, 165 – 176.
  13. Estimation of Molecular Averages and Equilibrium Fluctuations in Lipid Bilayer Systems from Excess Heat Capacity Function. Freire E., Biltonen R., “Biochim. Biophys. Acta”, (1978), 514, 54 – 68.
  14. The Ordered – Fluid Transition in Lipid Bilayers. Jдhnig F., “Mol. Cryst. and Liquid Cryst.” (1981), 63(1 – 4), 157 – 170.
  15. Термодинамика, статистическая физика и кинетика. Ю.Б. Руммер, М.Ш. Рывкин, (1972), М., “Наука”, стр.209 – 210.
  16. Relation Between Various Phospholipase Action on Human Red Cell Membranes and the Interfacial Phospholipid Pressure in Monolayers. Demel R.A., Geurts van Kessel W.S.M., Zwaal R.F.A., Roelofsen B., van Deenen L.L.M., “Biochim. et. Biophys. Acta”, (1975), 406, No 1, pp. 97 – 107. (Прототип для данной заявки.)
  17. A Theory of the Electric Field – Induced Phase Transition of Phospholipid Bilayers. Sugбr I.P., “Biochim et. Biophys. Acta”, (1979), 556(1), pp. 72 – 85.
  18. Электрический пробой бислойных мембран. Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф., Тарасевич М.Р., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А., “Доклады АН СССР”, (1978), 240, № 3, 733 – 736.
  19. Электрический пробой бислойных липидных мембран. I. Общая часть. Черномордик Л.В., Абидор И.Г., Тарасевич М.Р., “Биофизика мембран”, (1981), М., “Наука”, 184 – 191.
  20. Electric Breakdown of Bilayer Lipid Membranes. I. The Main Experimental Facts and Their Qualitative Discussion. Abidor I.G., Arakelyan V.B., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Yu.A., Pustushenko V.F., Tarasevich M.R., “Bioelectrochem. and Bioenerg.”, (1979), 6(1), 37 – 52.
  21. Theoretical Study of Protein – Lipid Interactions in Bilayer Membranes. Owicki J.C., Springgate M.W., McConnell H.M., “Proc. Nate. Acad. Sci. USA”, (1978), 75, No 4, 1616 – 1619.
  22. Способ определения поверхностного давления биологических мембран. С.Н. Семёнов, Н.И. Королёв. Авторское свидетельство на изобретение. SU 1465768, MCI G 01 N 33/483, 1989.
  23. Мембраны бактерий и механизм действия антибиотика Грамицидина S. А.С. Капрельянц, В.В. Никифоров, А.И. Мирошников, Л.Г. Снежкова, В.А. Ерёмин, Д.Н. Островский “Биохимия” (1977), 42(2), 329 – 337.

 

ЛАТЕРАЛЬНОЕ ДАВЛЕНИЕ.

Мелиттин на границе раздела полярной и неполярной фаз.

С.Н. Семёнов

Представляет большой интерес изучение взаимодействия мембрано-активных соединений с модельными липидными системами. Эти исследования позволяют выяснить как молекулярные основы биологического действия этих соединений, так и механизм липид-белковых взаимодействий, и их влияние на структуру и свойства мембран, как самостоятельной биосистемы, так и на структуру отдельных её составных частей. Данная работа посвящена изучению мелиттина – основного литического компонента пчелиного яда, где его концентрация доходит до 50 % (1) – на границе раздела фаз вода – воздух и его взаимодействию с липидными монослоями.

Мелиттин – соединение с молекулярным весом 2840 – по своей структуре относится к катионным детергентам. Сопоставление его действия на бактериальные мембраны и фосфолипидные липосомы позволило сделать вывод, что пептид действует на липидную область биомембраны (2). Физико-химические исследования, проведенные на модельных системах, показали, что мелиттин оказывает влияние, как на полярные, так и неполярные части липидных молекул (3, 4), образуя при этом комплексы с фосфолипидами (5). Известный механизм действия мелиттина достаточно схематичен и не даёт чёткого понимая роли высокой поверхностной активности мелиттина в его биологической активности (6, 7).

Продолжая исследования зависимости между структурой и функцией мембрано-активных соединений было изучено поведение мелиттина и ряда его аналогов на границе раздела фаз вода – воздух, а так же взаимодействие некоторых из них с фосфолипидными монослоями. В работе использовали мелиттин, его ацетиллированная производная, NPS – мелиттин и укороченный с N-конца на 7 аминокислотных остатков аналог, именуемый в тексте, Val – мелиттин.

Материалы и методы.

Очищенный мелиттин, выделенный из пчелиного яда, его ацетиллированная производная, NPS-мелиттин и Вал - мелиттин, были любезно предоставлены сотрудниками ИБХ им. М.М. Шемякина АН СССР (РАН) Мирошниковым А.И., и Сотниченко А.И. В работе использовались водные растворы соединений мелиттинового ряда, приготовленные растворением соответствующих навесок в дважды дистиллированной воде. Исходные концентрации растворов были 4,7 10-4 М – 1,35 10-3 М. В растворах с такими концентрациями мелиттин находился в виде тетрамеров (1).

Хроматографически однородные препараты яичного фосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидной кислоты любезно предоставлялись Барсуковым Л.И. и Молотковским Юл.Г. (ИБХ им. М.М. Шемякина АН СССР). Фосфатидная кислота растворялась в смеси метанол – хлороформ, объёмные отношения 1:2. Фосфатидилхолины растворялись в смеси хлороформ – метанол – гексан, с отношением 1:1:3. Полученные растворы имели концентрации (2,0 – 6,3)10-3 М.

Максимальное содержание растворителей в водной фазе при монослойных измерениях не превышало 0,2 %, что, как было предварительно проверено, не влияло на свойства монослоёв.

Измерения параметров монослоёв приводилось по методике и на установке, описанной ранее (8, 9).

Результаты и обсуждение.

На рис.1 представлено изменение поверхностного давления (ΔР) при сжатии монослоёв мелиттина, нанесённых на поверхность водных растворов с различной концентрацией КС1. Обращает на себя внимание почти двукратное увеличение площадей (S), приходящихся на молекулу пептида в коллапсе, при переходе от сжатия монослоёв на поверхности Н2О (кривая 1) к сжатию на мМ растворе КС1 (кривая 2) и при переходе от мМ раствора к 0,01 М и более концентрированным растворам КС1 (кривые 3 и 4).

Такое поведение мелиттина в монослоях привело к предположению, что увеличение ионной силы подстилающего раствора приводит к диссоциации агрегатов мелиттина. Сопоставляя полученные данные по сжатию монослоёв мелиттина с молекулярным весом пептида в чистой воде, равным 12000 (1), можно говорить, что диссоциация происходит от тетрамера, существующего в объёме и на поверхности Н2О, до мономера. Этот процесс может идти в две стадии, с образованием промежуточной димерной формы, которая хорошо видна при коллапсе монослоёв, нанесённых на поверхность 0,001 М раствора КС1 (рис. 1, кривая 2). На справедливость предположения о диссоциации тетрамеров указывает и то, что растворённый в мМ аммоний – ацетатном буфере мелиттин не проходит через полупроницаемое волокно, рассчитанное на задержание молекул с молекулярным весом более 5000. Тогда как растворённый в 1М буфере пептид свободно проходит через используемое волокно.

Изотермы сжатия мелиттина на границе раздела фаз вода-воздух.

Для более точного анализа процессов, происходящих при сжатии монослоёв мелиттина, использовал уравнение Ван-дер-Ваальса для двумерного газа, каковым является вещество в монослое:

ΔР S = ΔP S0 + (M/μ) RT + O(S) (1)

где

ΔРповерхностное давление монослоя;

S - площадь, приходящаяся на молекулу вещества в монослое;

S0 - площадь молекулы вещества;

М - масса вещества, образующего монослой;

μ - молекулярный вес вещества, образующего монослой;

R - универсальная газовая постоянная;

Т - абсолютная температура в градусах Кельвина;

O(S) – члены, учитывающие иные взаимодействия молекул в монослое, кроме их теплового движения в монослое.

Обозначая (М/μ)RT через β перепишем уравнение (1) в следующем виде:

ΔР S = ΔР S0 + β + О(S) (2)

Если иными взаимодействиями, кроме теплового движения молекул в монослое, можно пренебречь [О(S) = 0], то, откладывая по оси абсцисс поверхностное давление, а по оси ординат произведение поверхностного давления на площадь, приходящуюся на одну молекулу вещества в монослое, должны получить прямую линию с тангенсом угла наклона равным площади молекулы (S0) и свободным членом β – обратно пропорциональным молекулярному весу вещества в монослое.

На рис. 2 изображены типичные изотермы сжатия отдельных монослоёв мелиттина, построенные в координатах Ван-дер-Ваальса, и приведены их параметры (r – коэффициент корреляции). Видно (рис. 2А), что на 1 М растворе КС1 пептидные молекулы могут существовать, как минимум, в двух состояниях, когда можно пренебрегать межмолекулярными взаимодействиями в монослое. Одно из этих состояний, наступающее при поверхностном давлении выше 6,5 дин/см, наблюдается затем вплоть до коллапса монослоя. Надо отметить хорошее совпадение между площадью молекулы мелиттина (S0), рассчитанной с помощью уравнения 2, и определённой непосредственно из коллапса (см. рис. 1, кривые 3 и 4), когда пептидные молекулы плотно упакованы и уже нельзя пренебрегать межмолекулярными взаимодействиями в монослое. В диапазоне давлений 1,5 – 5 дин/см поведение монослоя описывается существенно другой величиной β, близкой по своему значению к величине β, полученной для мелиттина на поверхности 0,001 М раствора КС1 (рис. 2Б). Это указывает, что в монослое на поверхности 1М раствора КС1, мелиттин может находиться при низких поверхностных давлениях, по крайней мере, в виде димеров, распадающихся при сжатии до мономеров. Для монослоёв на поверхности чистой воды значение параметра β лежит в пределах 60 – 85, что указывает на более высокую степень агрегации пептида, по сравнению с монослоями на поверхностях солевых растворов с концентрацией КС1 выше 0,001 М.

Изотермы сжатия мелиттина на поверхности 1 М раствора KCl в координатах Ван дер Вальса.

Изотермы сжатия мелиттина на поверхности 0,001 М раствора KCl в координатах Ван дер Вальса.

 

Полученное более чем двукратное различие молекулярных весов тетрамера и димера, также димера и мономера (сравните величины β на рис 2А и 2Б), по-видимому, связано с различиями взаимодействия с границей раздела разных агрегационных форм пептида. В частности, как об этом будет сказано ниже, с наличием или отсутствием свободных положительных зарядов в молекуле мелиттина, что, естественно, влияет на гидратные оболочки аминогрупп пептида, ориентированных в подстилающий раствор. Различия во взаимодействии агрегационных форм пептида с подстилающим раствором должны сказываться на величине “кажущегося” молекулярного веса и влиять на величину параметра β, что и наблюдается в эксперименте.

Полученные различия в величине площади димера на поверхности 0,001 М и 1 М растворов КС1 (S0 = 130 ± 10 Ǻ2 и ~ 400 Ǻ2) очевидно связаны с различной ориентацией агрегатов на границе раздела фаз вода – воздух.

Полученные данные говорят, что повышение ионной силы подстилающего раствора способствует диссоциации агрегатов мелиттина в монослое. Такие аномальные с точки зрения электростатики, агрегационные свойства могут быть объяснены только при помощи специфических взаимодействий между неполярными участками молекул мелиттина. Сделанный вывод автоматически требует изменения структуры молекулы в процессе диссоциации. Только в этом случае могут резко меняться взаимодействия гидрофобных участков молекул между собой. Определённые на основе кривых сжатия изменения свободной энергии перехода были примерно равны 3 – 10 ккал/моль. Энергии равны работе по сжатию монослоёв мелиттина от 0 до величины поверхностного давления, при котором происходит смена агрегационного состояния или работе по сжатию монослоя, при котором агрегационное состояние молекулы полипептида не меняется.

Для подтверждения сделанного выше вывода о влиянии гидрофобного участка молекулы на агрегационные свойства пептида, на границе раздела фаз были исследованы NPS-мелиттин и Val-мелиттин. Исходно полагали, что эти аналоги должны образовывать более стабильные ассоциаты, чем природный мелиттин. Первый – за счёт добавления гидрофобной NPS-группы к N-концевому участку молекулы мелиттина, второй – за счёт ослабления электростатического отталкивания неполярных хвостов молекулы пептида, так как отсутствует положительно заряженный остаток лизина в 7 положении.

На рис. 3 изображены изотермы сжатия NPS-мелиттина, нанесённого на поверхность растворов с различной концентрацией КС1. Видно, что увеличение гидрофобности N-конца молекулы мелиттина увеличивает её агрегационную способность. Даже при сжатии на концентрированных солевых растворах, когда весь мелиттин переходит при сжатии в мономерную форму, ясно видны различные агрегационные состояния аналога, обладающие разным поверхностным давлением коллапса (рис. 3, кривые 2 и 3). Это говорит о том, что затраченной при сжатии монослоя работы недостаточно для полной диссоциации агрегатов NPS-мелиттина и/или активационный барьер между состояниями таков, что процесс диссоциации агрегатов протекает медленнее, чем у исходного пептида.

Изотермы сжатия мелиттина на поверхности водных растворов.

 

Как видно на рис. 4А, отсутствие 7-членного N-концевого участка у молекулы Val-мелиттина привело к падению величины поверхностного давления коллапса по сравнению с природным пептидом. Анализ изотермы сжатия с использованием уравнения 2 показал (рис. 4Б), что на поверхности 1М раствора КС1 существует 2 состояния вещества, отличающихся молекулярным весом агрегатов. Минимальный молекулярный вес агрегатов (для состояния, наступающего при поверхностном давлении выше 3 дин/см) близок к тому, который имеют димеры мелиттина. Для этого сопоставления использовалось приведённое значение β, равное 280 и учитывающее тот факт, что мол.вес Val-мелиттина на 640 меньше, чем у мелиттина. При переходе к 0,01 М раствору КС1 площадь, приходящаяся на молекулу этого аналога, в коллапсе уменьшилась до 45 ± 5 Ǻ2 при поверхностном давлении 15,5 ± 0,5 дин/см. При этом повышается растворение вещества из монослоя по сравнению с 1 М раствором КС1. Для чистой воды не удалось снять изотермы сжатия Val-мелиттина из-за сильного растворения из монослоя в подстилающем растворе.

Рис. 4.А

Рис. 4.Б

Изотермы сжатия NPS-мелиттина на поверхности 1 м раствора KCl.

Полученные данные говорят о том, что изменение неполярной области молекулы мелиттина меняет её агрегационные свойства. Т.е. влияет на способность пептида диссоциировать на границе раздела до мономерной формы.

Интересно отметить, что скачок потенциала мономеров мелиттина в коллапсе не зависит от ионной силы подстилающего раствора (рис. 5). Это указывает на то, что мономеры мелиттина ведут себя на границе раздела фаз как электронейтральные молекулы. (Вертикальная составляющая дипольного момента мономеров мелиттина равна 3,8 ± 0,4 Дебая.) По-видимому, такое поведение пептида, как и в случае грамицидина S [8, 9], связано с его способностью образовывать комплексы с анионами из подстилающего солевого раствора. Следовательно, диссоциация агрегатов мелиттина затрагивает и полярную область молекулы.

Чтобы изучить влияние свободных зарядов молекулы мелиттина на её агрегационные свойства, на границе раздела фаз вода – воздух был исследован ацетиллированный аналог. На рис. 6 изображены зависимости поверхностного давления монослоёв ацетиллированного аналога в зависимости от площади, приходящейся на одну молекулу. Легко заметить близость площадей, приходящихся на молекулу аналога при коллапсе монослоёв, нанесённых на поверхность растворов с концентрацией КС1 выше 0,001 М (кривые 3 и 4), и площади мономера мелиттина (рис. 7).

Рис. 5.

Зависимость скачка потенциала (ΔV) от площади молекулы мелиттина на поверхности водных растворов.

Рис. 6.

Изотермы сжатия ацетиллированного мелиттина на поверхности водных растворов KCl.

Рис. 7.

Изотермы сжатия мелиттина (1) и его ацетиллированного аналога на поверхности растворов с концентрацией KCl > 0,001 M.

Анализ изотерм сжатия монослоёв ацетиллированного мелиттина, нанесённых на поверхность 0,001 М раствора КС1 показал, что в диапазоне поверхностных давлений от 5 дин/см до 13 – 15 дин/см: S0 = (300 ± 20) Ǻ2, β = 950 ± 30 и r не ниже 0,9997. До давлений 5 дин/см изотермы сжатия в координатах Ван-дер-Ваальса не описываются хорошей прямой, что указывает на наличие специфических взаимодействий между молекулами в монослое. Величина β говорит о переходе ацетиллированного аналога в мономерную форму уже при сжатии на поверхности 0,001 М КС1 (сравните с поведением мелиттина, рис 2А и 2Б). Таким образом, подтверждается сделанный ранее вывод, что электронейтрализация положительно заряженных аминогрупп пептида способствует его диссоциации до мономерной формы. Такая диссоциация агрегатов невозможно без структурных (конформационных) изменений в молекулах мелиттина. Так без таких изменений, только за счёт снижения электростатического отталкивания молекул в агрегате, более лёгкий развал агрегатов – событие невероятное.

После исследование соединений группы мелиттина на границе раздела фаз вода – воздух, было изучено его взаимодействие с фосфолипидными монослоями. (Титрования монослоёв, сформированных из яичного лецитина, мелиттином, введённым в подстилающий водный раствор. Результаты не показаны.) Наблюдаемый при титровании рост поверхностного давления липидных монослоёв, до величин, превышающих поверхностное давление мелиттина в коллапсе, говорит о специфическом взаимодействии пептида с фосфолипидом. Рост поверхностного давления при титровании сильно уменьшается, а при высоких поверхностных давлениях прекращается совсем, при достижении соотношения мелиттин : фосфолипид = 1 : 5. Отсюда следует, что в результате взаимодействия образуется высоко поверхностно-активный пептид – липидный комплекс, состоящий из одной молекулы мелиттина, связанной с пятью фосфолипидными молекулами.

Слабый рост поверхностного давления монослоёв при добавлении в раствор избыточных количеств мелиттина, по-видимому, связан с полислойной адсорбцией пептида под границей раздела фаз. Подтверждением этого служит тот факт, что включение мешалки, в этом случае, вызывает небольшое обратимое падение поверхностного давления (2 – 3 дин/см). А при концентрациях мелиттина ниже необходимых для насыщения, мешалка практически не оказывала влияния. Так же некоторый рост поверхностного давления может быть связан с образованием некоторого числа комплексов, содержащих менее пяти липидных молекул, связанных с одной молекулой мелиттина. Это приводит к некоторому увеличению количества комплексов в монослое и, следовательно, к росту поверхностного давления.

Очевидно, что образование комплексов состава 1 : 5 происходит тогда, когда липида, по крайней мере, в пять раз больше, чем мелиттина. В противном случае образуются “ненасыщенные” комплексы.

Используя значения поверхностного давления, соответствующие насыщению на кривых титрования липидного монослоя или результаты взаимодействия мелиттина с пятикратным количеством фосфолипида на границе раздела фаз вода – воздух, были построены кривые сжатия пептид – липидного комплекса. Площадь, приходящаяся на один пептид – липидный комплекс в коллапсе (S = 300 ± 15 Ǻ2), совпадает с площадью мономера мелиттина.

Показано, что заряженные аналоги мелиттина образуют комплексы с липидом, максимальное поверхностное давление которых существенно меньше аналогичной величины исходного соединения. Так, Вал-мелиттин при взаимодействии с монослоями, сформированными из яичного лецитина на поверхности 0,001 М раствора КС1, образует пептид – липидные комплексы, поверхностное давление которых в коллапсе равно 20 ± 1 дин/см. Данных о структуре на границе раздела фаз для комплексов укороченного аналога мелиттина с фосфолипидом не получено. (Для самого Вал-мелиттина не наблюдалась такая, как у мелиттина, диссоциации его агрегатов до мономеров при электронейтрализации на границе раздела полярной и неполярной фаз.)

Следует отметить, что при поверхностном давлении в диапазоне 20 – 25 дин/см наблюдался разброс экспериментальных точек, описывающих зависимость поверхностного давления от площади, приходящейся на один липид – пептидный комплекс. Вероятно, как и в случае с грамицидином S, это связано с изменением ориентации липидных молекул на границе раздела фаз при связывании с мелиттином.

Сопоставление поверхностной активности природного мелиттина и его аналогов с их биологическим действием позволяет сделать вывод, что для такого сравнения нужно использовать не параметры самих молекул, а их комплексов с липидом. Вообще говоря, биологическая активность соединений мелиттинового ряда должна зависеть от поверхностной активности их комплексов с липидом, количества связанного в комплекс липида (чем больше молекул связано в комплекс, при прочих равных условиях, тем выше биологическая активность данного соединения), и способности соединения диссоциировать до мономерной формы. Естественно, что чем больше комплексов в мембране, тем больший эффект на её структуру они оказывают.

Внедрение комплексов в мембрану нарушает её структуру, что должно приводить к появлению “мозаичной структуры” (8, 9, 11), т.е. возникновению участков липидного бислоя, разделённых между собой пептид-липидными комплексами и, вероятно, мембранными белками. Этот процесс и есть начало разрушения мембраны. Далее, разделённая на отдельные фрагменты, мембрана переходит в коллоидный раствор, что наблюдалось ранее при изучении действия мелиттина на фосфолипидные ламеллярные структуры (7).

Однако, основной вывод данной работы не в том, как мелиттин взаимодействует с липидом, и не в том, что при этом происходит с мелиттином и/или липидом, и как происходит разрушение биологической мембраны.

Основной вывод в том, что все изменения, которые происходят с мелиттином, а также грамицидином S, кардиотоксином – всеми молекулами, для которых это специально проверялось – обусловлено латеральным сжатием. А природа такого сжатия может быть различна. Только механического латерального сжатия достаточно для изменения конформации, агрегационного состояния или электрического заряда молекул на границе раздела полярной и неполярной фаз.

Термины “латеральное сжатие” и “поверхностное давление” здесь и далее будут использоваться для того, что бы разделять силовой параметр и энергетический параметр при описание свойств границы раздела.

Список литературы.

  1. E. Haberman, “Science”, (1972), 177, 314 – 322.
  2. J.C. Williams, R.M. Bell, “B.B.A.” (1972), 288, 255 – 262.
  3. S.P. Verma, D.F. Wallach, I.C.P. Smith, “B.B.A” (1974), 345, 129 – 140.
  4. C. Mollay, “FEBS Lett.” (1976), 64, 65 – 68.
  5. C. Mollay, G. Kreil, “B.B.A.” (1973), 316, 196 – 203.
  6. J. Dufourcq, J.-F. Faucon, “B.B.A.” (1977), 467, 1 – 11.
  7. G. Sessa, J.H. Freer, G. Colacicco, G. Weissmann, “J. Biol. Chem.” (1969), 244, 3575 – 3582.
  8. S.N. Semenov, L.G. Snezhkova, A.I.Miroshnikov, V.Т.Ivanov, Yu.A.Ovchinnikov, Abstracts of Soviet – French Symp. on the Phys. Chem. of Proteins and Peptides, Sep. 9 –12, 1975, pp. 28 – 29.
  9. СемёновС.Н., Мельник Е.И., Снежкова Л.Г., Мирошников А.И., Иванов В.Т., “Биоорган. Хим.” (1977), 3(8), 1055 – 1063.
  10. D. Papahadjopoulos, “Form and Function of Phospholipids”, edit. G.B. Ansell, J.N. Hawthorne, R.M.C. Dawson, “Elsevier Scientific Publishing Company” Amsterdam – London – New York, (1973), pp. 161 – 164.
  11. Мирошников А.И., Семёнов С.Н., Снежкова Л.Г., Сотниченко А.И., Иванов В.Т., Всесоюзный симпозиум “Физиологическая роль поверхностно-активных веществ” (1975), Черновцы, стр. 69.

МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН.

  1. КВАЗИСТАТИКА

В настоящее время общепринята “мозаичная модель” строения биомембран, согласно которой мембраны состоят из липидного бислоя и “плавающих” в нём молекул белка (1 – 4). Выяснено, что мембраны являются весьма динамичными структурами, различные компоненты которых обладают высокой латеральной и вращательной степенями свободы (5 – 9). Обнаружено, что при нормальных условиях, большинство мембранных липидов находится в жидкокристаллическом состоянии (5 – 9,). К примеру, при нормальных условиях роста мембраны микроорганизмов Micoplasma laidlawii, Micrococcus lysodeikticus и Escherichia coli образуют “жидкую фазу”, характеризующуюся высокой подвижностью углеводородных цепей молекул липида (10).

Изменение температуры окружающей среды приводит к изменению жирно-кислотного состава молекул фосфолипидов, входящих в состав клеточных мембран (11, 12). Повышение температуры приводит к уменьшению доли ненасыщенных жирных кислот, а уменьшение – к увеличению их доли (11). Аналогичные изменения в фосфолипидном составе биомембран, кроме температуры, может вызывать и введение в гидрофобную область молекул, нарушающих микровязкость биомембраны (12). Увеличение доли ненасыщенных жирных кислот понижает микровязкость мембран (13), т.е. позволяет поддерживать мембранные липиды в “жидкой фазе”. При этом, максимальный эффект даёт замена насыщенных жирных кислот на жирные кислоты с одной двойной связью. Дальнейшее увеличение количества двойных связей приводит к незначительному увеличению текучести мембраны (11).

Полученные в моих работах результаты, их сопоставление с литературными данными позволило предложить новую “МОЛЕКУЛЯРНО – МЕХАНИЧЕСКУЮ” МОДЕЛЬ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОМЕМБРАН. Предложенная модель отличается от общепринятой тем, что вместо полуэмпирического параметра микровязкости (текучести) мембраны вводится близкий, но имеющий иной конкретный физический смысл, абсолютно пригодный для описания мембран. ПАРАМЕТР – ЛАТЕРАЛЬНОЕ ПОВЕРХНОСТНОЕ ДАВЛЕНИЕ МЕМБРАНЫ (*). Термин ЛАТЕРАЛЬНОЕ введён с целью подчеркнуть тот факт, что давление действует в направлении, параллельном поверхности мембраны.

*Пояснение. Вязкость (как и микровязкость) введена для описания движения тела (как и микро тела) в жидкой физической среде. Естественно, что биомембрана жидкой физической средой не является. БИОМЕМБРАНА – БИОМЕМБРАНА И ЕСТЬ.

Вязкость (как и микровязкость) используется для описания самого движущегося тела в среде, а не для описания среды, как целой самостоятельной системы. Окружающая среда учитывается в параметре “вязкость” опосредованно, если она и учитывается. Кстати, молекулярный зонд, используемый для определения “микровязкости”, требует для своего описания нечто иное, а не только гидродинамику.

Аналогичная ситуация и с “текучестью” мембраны.

Использование этих терминов, из-за их кажущейся понятности, только затрудняет понимание строения и функционирования биомембран.

Биомембраны – это биомембраны – особая, анизотропная система, в которой на дистанции, а то и меньше, одной входящей в неё молекулы, видны свойства различных физических систем. Эти различные физические системы могут находиться ещё одновременно в нескольких агрегационных состояниях.

Латеральное поверхностное давление отражает плотность упаковки молекул в мембране. Чем ниже латеральное поверхностное давление, т.е. чем ниже плотность упаковки молекул, тем, естественно, ниже микровязкость среды. Потому, что с понижением плотности упаковки молекул в системе, мы приближаемся к пустоте, а в пустоте уже нечему оказывать сопротивление движению молекул-зондов, которые используют для измерения вязкости различных мембран. Вот почему выше и было сказано, что поверхностное давление и “микровязкость” мембраны близки между собой. Эта близость заключается в корреляции между ними.

Необходимость введения понятия поверхностного давления мембраны возникла при изучении молекулярного механизма действия детергентов, проведённого мной ранее (см. предыдущие статьи данного сборника и цитируемую там литературу). Знание величины поверхностного давления мембраны позволило предсказывать лизирующую активность ряда соединений, зависимость их биологической активности от температуры, способность белков работать в мембране и т.д. Полученные результаты оформлены в виде изобретения “Способ определения поверхностного давления биомембран”, а теоретическое и практическое обоснование изобретения опубликовано в данном сборнике.

Поверхностное давление мембраны позволяет существовать в ней не произвольным белкам, а только тем, для которых изменение свободной энергии при взаимодействии с границей раздела полярной и неполярной фаз превышает поверхностное давление данной мембраны. В противном случае, молекулы белка не могут свободно проникать в мембрану и/или находиться в ней достаточно долгое время. Кроме того, наличие поверхностного давления означает, что на любую молекулу в мембране действует сила сжатия, направленная от периметра частицы к её центру, в направлении, параллельном плоскости мембраны (рис. 1), стремящаяся сжать и сжимающая, как показано мною для грамицидина S, мелиттина и кардиотоксина, молекулу белка.

Рис. 1

Действие латерального поверхностного давления мембраны на мембранные белки. Для пояснения см. текст.

Таким образом, наличие поверхностного давления даёт возможность мембранным белкам принимать “напряжённую” конформацию, которая в растворах часто просто в принципе не может наблюдаться.

Кроме того, грубо можно говорить, что, так как сила давления действует на любую частицу в мембране в направлении по нормали к её поверхности, то для любых молекул белка с формой гидрофобной области, которая погружена в мембрану, отличающейся от цилиндрической (рис. 1), будет возникать выталкивающая сила (Fc). Эта сила стремится убрать частицу (молекулу) с границы раздела фаз мембрана – окружающая среда. Причём сила выталкивания может быть направлена и в центр мембраны (на рисунке не показано). Именно этому процессу и противодействует поверхностная активность мембранного белка.

Полученные мною результаты по определению поверхностного давления некоторых цитоплазматических мембран (см. 1-ю статью данной серии) показали, что значения поверхностных давлений мембран различных клеток, в том числе и микроорганизмов, значительно отличаются по своей величине. В связи с этим может оказаться, что неудачные попытки получения генетически изменённых микроорганизмов обусловлены тем, что белки, характерные для клетки донора, просто не могут существовать в мембране нового носителя (реципиента) и, следовательно, не могут функционировать. Так, к примеру, ацетилхолиновый рецептор не мог находиться в фосфолипидных монослоях, поверхностное давление которых превышало 28 дин/см при рН 7,0, а холиностераза – в монослоях, поверхностное давление которых превышало 24 дин/см (14).

 

Наличие латерального поверхностного давления, действующего на молекулу белка в мембране, как и на любую другую молекулу, приводит к появлению у последней новой “напряжённой” конформации, которая характеризуется добавочной поверхностной конформационной энергией. Добавочная энергия равна работе по сжатию мембранных компонент от нулевого поверхностного давления до давления, равного поверхностному давлению данной мембраны. Эта энергия (ЕЛ) равна:

Пределы интегрирования: от 0 до Рm,

где Р(S) – функция зависимости поверхностного давления монослоя от площади S приходящейся на одну молекулу в монослое;

Рmповерхностное давление биомембраны;

θ – коэффициент, учитывающий геометрию молекулы (грубо – её периметр и/или площадь контакта молекулы с её внутри мембранным окружением) и используемую систему единиц.

Иными словами, добавочная конформационная энергия равна площади фигуры, ограниченной изотермой сжатия монослоя от полностью расширенного состояния до поверхностного давления, равного поверхностному давлению данной биологической мембраны (Рм), прямой Р = Рм и ось ординат (рис. 2).

Рис. 2.

(См. пояснение в тексте.)

Причём, как следует из монослойных экспериментов, увеличение степени ненасыщенности жирнокислотных цепей молекул фосфолипидов, при прочих равных условиях, приводит к возрастанию добавочной энергии сжатия для частиц, находящихся в биологических мембранах, содержащих эти липиды (увеличивается площадь заштрихованной фигуры на рис. 2). Следовательно, увеличение доли ненасыщенности углеводородных цепей молекул липида приводит к увеличению добавочной конформационной энергии мембранного белка при данном значении поверхностного давления биомембраны. Т.е., возможно увеличивать энергию сжатия мембраны, с которым она действует на проникающие мембранные белки, без увеличения латерального поверхностного давления самой мембраны.

Иными словами, наличие полиненасыщенных жирных кислот в биомембране позволяет получать выигрыш в величине добавочной конформационной энергии без увеличения самого поверхностного давления мембраны. Таким образом, может достигаться компромисс между относительно низким поверхностным давлением мембранных белков, позволяющего последним проникать и встраиваться в мембрану на границе раздела фаз, и добавочным значением конформационной энергии белковой молекулы, обеспечивающей наличие у неё оптимальной структуры.

Имеющиеся экспериментальные данные подтверждают этот вывод, что мембраны клеток характеризуются не только определённым поверхностным давлением, но и различной сжимаемостью, т.е. различной зависимостью изменения поверхностного давления мембраны от плотности упаковки в ней молекул (15).

Кстати, отсюда следует, что липидная матрица нормально функционирующих биомембран должна быть “жидкой”. Потому, что при “кристаллизации” мембранных липидов резко падает величина добавочной энергии сжатия, получаемой проникающими мембранными белками. Это наглядно видно на рис. 2, где схематично изображены изотермы сжатия монослоёв для “жидкой” (пунктирная линия) и “кристаллической” (сплошная линия) мембран. В последнем случае величина добавочной энергии равна нескольким kT на одну молекулу в мембране и сравнима с энергией теплового движения (k – константа Больцмана, Т – абсолютная температура в градусах Кельвина). Поэтому, если мембрана при обычных условиях будет содержать липиды в “кристаллическом” состоянии, то температурные флюктуации (иначе – тепловой шум) будут вызывать флюктуации в структуре мембранных белков – их резкое изменение состояния – и, соответственно, резкие случайные изменения их активности. Такие хаотические изменения активности мембранных систем, естественно, явление несовместимое с самим существованием жизни. Можно сказать и проще, в нормальной мембране фазовый переход липида в “кристаллическое” состояние приводит к появлению у проникающего мембранного белка возможности “расползтись”, т.е. изменить свое состояние и инактивироваться.

Ранее была рассмотрена важность наличия у биомембран их поверхностного (латерального) давления, необходимого для нормального функционирования проникающих мембранных белковых систем. В данной работе дано краткое обоснование важности наличия у биологической мембраны ещё и определённой латеральной упругости (dP/dS) или латеральной сжимаемости (dS/dP). Видно, что латеральная упругость является величиной, обратной латеральной сжимаемости. Латеральная сжимаемость будет рассмотрена далее более подробно. Здесь стоит только ещё раз напомнить, что наличие двойных связей в углеводородных цепях липидных молекул приводит к увеличению латеральной сжимаемости биомембраны. Точнее, той половины мембраны, где эти связи присутствуют. В рамках рассматриваемой модели, как будет ясно в дальнейшем, такое утверждение корректно, т.е. мембрану можно рассматривать, как систему, состоящую липидной матрицы и находящихся в ней мембранных белков. В свою очередь, липидная матрица сама по себе тоже является сложной системой, состоящей из двух подсистем – липидных монослоёв.

Таким образом, ответ на вопрос проф. Д. Чапмена, FRS: “Зачем нужны двойные связи?”, звучит: “Они обеспечивают и поддерживают латеральную сжимаемость (упругость) биологических мембран, которая обеспечивает добавочную латеральную энергию сжатия, получаемую проникающими мембранными белками со стороны окружающей их липидной матрицы биологической мембраны”.

Из кратко изложенной в этой работе “Молекулярно-механической модели биомембран” вытекает, что встраивание инородных молекул (дефектов структуры) должно приводить к изменению плотности упаковки молекул в мембране, т.е. к изменению её поверхностного давления и (латеральной) сжимаемости. Поэтому, на начальных стадиях, когда ещё не происходит лизис клеток, должна меняться активность мембранных белков, что подтверждается литературными данными (16 – 23).

В пользу этого говорит и собственное изучение влияния грамицидина S и его аналогов на кинетику релаксации фотохимического цикла бактериородопсина во фрагментах фотосинтезирующих мембран галофильных микроорганизмов Halobacteriuv halobium. Было показано методом стоп-флоу (24), что в малых концентрациях, когда не происходило разрушение мембран, (фотохимический цикл сохранялся, а только менялась его кинетика), антибиотик и его заряженные аналоги действовали в соответствии с механизмом, описанным ранее (см. 1-ю статью данного сборника). Поверхностное давление мембран бактериородопсиновых бляшек, определенное по предложенной ранее методике, равнялось, примерно, 34,5 дин/см.

Аналогичный механизм позволяет объяснить экспериментальные результаты, полученные, на пример, при изучение действия местных анестетиков на биологические и модельные мембраны (25 – 30). Местные анестетики, внедряясь в мембрану, изменяют её толщину и степень подвижности углеводородных цепей молекул липида. Следовательно, они могут менять поверхностное давление мембраны и её сжимаемость, а, главное, меняют размер области контакта мембранного белка и окружающего липида, изменяя тем самым, структурное состояние белка, создающего канал проводимости в возбудимой мембране. (Анестетики увеличивают толщину липидного бислоя мембраны.)

Если предложенная Модель справедлива, то что бы компенсировать влияние анестетиков на биомембрану, нужно тем или иным способом свести на нет их влияние на мембрану. Наиболее просто это сделать практически – сжать мембрану. Сжать мембрану чисто механически, что бы уменьшить её толщину. Для это можно воздействовать на всю клетку гидростатическим давлением. Такое давление будет действовать всегда перпендикулярно поверхности биомембраны и действовать с обеих сторон мембраны в одном направлении – сжимая последнюю, что подтверждается экспериментально. Увеличение гидростатического давления уменьшало влияние местных анестетиков на клетки (31 – 33).

Латеральное давление мембраны вполне способно обуславливать возвращение проникающего мембранного белка в исходное состояние после элементарного акта внешнего воздействия (взаимодействия с субстратом, действия света и т.д.), приводящего белок в возбужденное состояние. В результате взаимодействия белка с субстратом выделяется некоторое количества энергии, часть из которой может идти, на пример, на увеличение объёма белка и преодоление сил сжатия со стороны мембраны. Затем, после диссипации энергии, мембрана, сжимая белок, возвращает его в исходное состояние. Таким образом, мембранная система автоматически вернулась в исходное состояние.

Цель данной работы заключается в обосновании необходимости введения понятия сжимаемости биологических мембран и в принципиальном рассмотрение физической роли этого параметра в функционирование различных сложных мембранных систем. Поэтому, многие детали сознательно опущены. Для данного квазистатического классического приближения они не существенны и будут рассмотрены позже. Возможно, в следующих разделах, касающихся динамического классического приближения, квантово-фононного, информационного и далее будет видно, каких ещё приближений и практических приложений, необходимых для понимания сути предлагаемого изобретения.

В рамках описанного механизма легко объясняется, на пример, процесс взаимодействия ацетилхолиностеразы с субстратом в липидных монослоях, предложенный ранее механизм инактивации каналов проводимости в возбудимых мембранах, действие высокого гидростатического давления на клетки (см. выше) и т.д.

Необходимо отметить, что даже в рамках данного приближения становится понятной ещё одна биологическая роль полиненасыщенных жирнокислотных остатков молекул фосфолипидов в биологических мембранах. Они, за счёт слабой зависимости поверхностного давления от площади, т.е. высокой сжимаемости, позволяют сглаживать пульсации поверхностного давления мембран.

Эти пульсации поверхностного давления могут возникать за счёт флюктуаций плотности компонент мембраны, внешних воздействий или функционирования мембранных (белковых) систем, в том числе и приводящих к изменению формы клеток

Таким образом, высокая сжимаемость мембран демпфирует пульсации поверхностного давления и, тем самым, повышает стабильность условий, в которых функционируют различные мембранные системы. Кстати, при постоянной температуре живой системы это делать проще. Однако, это уже вопросы последующих приближений описания предложенной “Молекулярно-механической модели…”.

Литература

  1. S.J. Singer, “A FLUID LIPID-GLOBULAR PROTEIN MOSAIC MODEL OF MEMBRANE STRUCTURE”, Ann. N.Y. Acad. Sci., (1972), 195, 16 –23.
  2. Robetson J.D., “MEMBRANE STRUCTURE”, "J. Cell Biol.", (1981), 91(3, part 2), 189 – 204.
  3. Л.Д. Бергельсон, “БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ”, изд. Наука”, Москва, 1975.
  4. Li K.-P., Chuang F.-S.S., “ANALYTICAL TECHNIQUES FOR THE STUDY OF BIOLOGICAL MEMBRANES”, “Contempt Top. Anal. and Clin. Chem.” (1979), vol. 3, pp 253 – 298, New York – London.
  5. Shinitzky M., Henkart P., “FLUIDITY OF CELL MEMBRANES – CURRENT CONCEPTS AND TRENDS”, Int. Rev. Cytology, (1979), 60, 121 – 147.
  6. Nigg E.A., Cherry R.J., “INFLUENCE OF TEMPERATURE AND CHOLESTEROL ON THE ROTATIONAL DIFFUSION OF BAND 3 IN HUMAN ERYTHROCYTE MEMBRANE”, Biochemistry, (1979), 18(16), 3457 – 3465.
  7. Hackenbrock C.R., “MOLECULAR ORGANIZATION AND THE FLUID NATURE OF MITOCHONDRIAL ENERGY TRANSDUCING MEMBRANE”, in the book "Structure of Biol. Membranes", ed., Abrahamsson S., Pasher I., Plenum Press, N.Y. – London, (1976), 199 – 233.
  8. Капрельянц А.С., “ДИНАМИЧЕСКИЕ БЕЛКОВЫЕ АНСАМБЛИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ”, Биохим., (1982), 47(6), 883 – 895.
  9. Hasselbash W., “THE SARCOPLASMIC CALCIUM PUMP. A MODEL OF ENERGY TRANSUDATION IN BIOLOGICAL MEMBRANES”, "Topics in Current Chemistry", (1979), 79, 1 – 56.
  10. Bell G.M., Combs L.L., Dunne L.J., “THEORY OF COOPERATIVE PHENOMENA IN LIPID SYSTEMS”, Bell Chem. Rev., (1981), 1(1), 15 – 48.
  11. Yang L.L., Hang A., “STRUCTURE OF MEMBRANES LIPIDS AND PHYSICO-BIOCHEMICAL PROPERTIES OF PLASMA MEMBRANES FROM THERMOPLASMA ACIDOPHILUM, ADAPTED TO GROWTH AT 37oC”, Biochim. Biophys. Acta, (1979), 573(2), 308 – 320.
  12. Nandini-Kishore S.G., Mattox S.M., Martin Ch.E., Thomson G.A., “MEMBRANES CHANGES DURING GROWTH OF Tetrahymena IN THE PRESENCE OF ETHANOL”, Biochim. Biophys. Acta, (1979), 551, 315 – 327.
  13. Seelig A., Seelig J., “EFFECT OF SINGLE CIS DOUBLE BOND ON THE STRUCTURE OF PHOSPHOLIPID BILAYER”, Biochemistry, (1977), 16, 45 – 50.
  14. Wiedmer T., Brodbeck U., Zahler P., Fulpius B.W., “INTERACTION OF ACETYLCHOLINESTRASE WITH LIPID MONOLAYERS”, Biochim. Biophys. Acta, (1978), 506, 161 – 172.
  15. Pattus F., Piovant M.C.L., Lasdunski C.J., Desnuella P., Verger R., “SPREADING OF BIOMEMBRANES AT THE AIR / WATER INTERFACE”, Biochim. Biophys. Acta, (1978), 507(1), 71 – 82.
  16. Kotelnikova A.V., Solovjeva N.A., Sholtz K.F., Snezhkova L.G., Miroshnikov A.I., “EFFECT OF GRAMICIDIN S AND IT’S DERIVATIVES ON THE CATIONS PERMEABILITY OF MITOCHONDRIAL MEMBRANES”, Abstract 10th FEBS Meeting, (1975), Paris, No 1129.
  17. Sholtz K.F, Solovjeva N.A., Kotelnikova A.V., Snezhkova L.G., Miroshnikov A.I., “EFFECT OF GRAMICIDIN S AND IT’S DERIVATIVES ON OF MITOCHONDRIAL MEMBRANES”, FEBS Lett., (1975), 58(1), 141 – 144.
  18. Helenius, K. Simons A., “SOLUBILIZATION OF MEMBRANES BY DETERGENTS”, Biochim. Biophys. Acta, (1975), 415, 29 – 79.
  19. Markwell J.P., Miles C.D., Boggs R.T., Thornber J.P., “SOLUBILIZATION OF CHLOROPLAST MEMBRANES BY ZWITTERIONIC DETERGENTS. EFFECT ON PHOTOSYSTEM II ACTIVITY. FEBS Lett., (1979), 99(1), 11 – 14.
  20. Bonnafous J.-C., Dornand J., Mani J.-C., “DETERGENT-LIKE EFFECT OF ALAMETHICIN ON LYMPHOCYTE PLASMA MEMBRANES”, Biochem. Biophys. Res. Comm., (1979), 86(3), 536 – 544.
  21. Zaslavsky B.Yu., Osipov N.N., Rogozhin S.V., “ACTION OF SURFACE-ACTIVE SUBSTANCES ON BIOLOGICAL MEMBRANES. III. COMPARISON OF HEMOLYTIC ACTIVITY OF IONIC AND NONIONIC SURFACTANTS”, Biochim. Biophys. Acta, (1978), 510, 151 – 159.
  22. Pitha J., Kociolek K., Caron M.G., “DETERGENTS LINKED TO POLYSACCHARIDES: PREPARATION AND EFFECTS ON MEMBRANES AND CELLS”, Eur. J. Biochem., (1979), 94, 11 – 18.
  23. Snow J.W., Brandts J.F., Low P.S., “THE EFFECTS OF ANION TRANSPORT INHIBITORS ON STRUCTURAL TRANSITIONS IN ERYTHROCYTE MEMBRANES. Biochim. Biophys. Acta, (1978), 512, 579 – 591.
  24. Ovchinnikov Yu.A., Shkrob A.M., Rodionov A.V., Mitzner B.I., “AN EFFECTIVE COMPETITIVE INHIBITOR OF BACTERIO-OPSIN - RETINAL RECOMBINATION”, FEBS Lett., (1979), 97(1), 15 - 19.
  25. R. Padron, L. Mateu, J. Requena, “A DYNAMIC X-RAY DIFFRACTION STUDY OF ANESTHESIA ACTION THICKENING OF THE MYELIN MEMBRANE BY n-PENTANE”, Biochim. Biophys. Acta, (1979), 552, 535 – 539.
  26. Snow J.W., Brandts J.F., Low P.S., “THE EFFECTS OF ANION TRANSPORT INHIBITORS ON STRUCTURAL TRANSITIONS IN ERYTHROCYTE MEMBRANES”, Biochim. Biophys. Acta, (1978), 512, 579 – 591.
  27. Franks N.P., Lieb W.R., “THE STRUCTURE OF LIPID BILAYERS AND THE EFFECTS OF GENERAL ANAESTHETICS. AN X-RAY AND NEUTRON DIFFRACTION STUDY”, J. Mol. Biol., (1979), 133(4), 469 – 500.
  28. Hill M.W., “THE EFFECT OF ANESTHETIC-LIKE MOLECULES ON THE PHASE TRANSITION IN SMECTIC MESOSPHERE OF DIPALMITOYLLECITHIN. I. THE NORMAL ALCOHOL UP TO C=9 AND THREE INHALATION ANESTHETICS. Biochim. Biophys. Acta, (1974), 356, 117 – 124.
  29. R.G. Ashcroft, H.G.L. Coster, J.R. Smith, “LOCAL ANESTETHETIC BENZYL ALCOHOL INCREASES MEMBRANE THICKNESS”, “Nature” (1977), 269(5631), pp. 819 – 820.
  30. Selwyn M.J., Fulton D.V., Dawson A.P., “INHIBITION OF MITOCHONDRIAL ANION PERMEABILITY BY LOCAL ANESTHETICS”, FEBS Lett., (1978), 96, 148 – 151.
  31. A.A. Harper, A.G. Macdonald, K.T. Wann, “THE ACTION OF HIGH HYDROSTATIC PRESSURE ON VOLTAGE-CLAMPED HELIX NEURONS”, J. Physiology, (1977), 277, 70 – 71.
  32. Wann K.T., MacDonald A.G., “THE EFFECTS OF PRESSURE ON EXCITABLE CELLS”, Comp. Biochem. and Physiol., (1980), 66A(10), 1 – 12.
  33. MacDonald A.G., “A DILATOMETRIC INVESTIGATION OF EFFECTS OF GENERAL ANESTHETICS, ALCOHOLS AND HYDROSTATIC PRESSURE ON THE PHASE TRANSITION IN SMECTIC MENOPAUSE OF DIPALMITOYLPHOSPHATIDYLCHOLINE”, Biochim. Biophys. Acta, (1978), 507, 26 – 37.

 

П. КВАЗИДИНАМИКА.

 

И так, к данному моменту имеем:

Биологические мембраны обладают собственной величиной поверхностного давления. Эта величина различна у мембран разных клеток, так и у мембран клеточных органелл (organelles), на пример, митохондрий.

Поверхностное давление биомембраны позволяет находиться в ней только тем мембранным молекулам (белкам и прочим), поверхностная активность (точнее, максимальное поверхностное давление) которых не ниже поверхностного давления данной биологической мембраны. Это относится как к собственно мембранным компонентам, как и к посторонним молекулам.

На каждую молекулу внутри мембраны действует сила латерального сжатия со стороны её окружения, стремящаяся сжать и сжимающая молекулу. Эта сила аналогична той, которая возникает при “механическом” соударении молекул на границе раздела фаз. В результате, в молекуле возникают некие внутримолекулярные “напряжения” и/или ограничения, которые отсутствуют в однородной среде – то есть в растворе.

Наличие латерального сжатия приводит к тому, что под его воздействием, мембранная молекула приобретает добавочную внутреннюю энергию ЕЛ, величина которой описывается интегралом, приведённым в предыдущей статье (см. 1. Квазистатика). Величина ЕЛ зависит от липидного состава данной конкретной биомембраны, особенно от углеводородных цепей молекул фосфолипидов, как показано в предыдущей работе (1. Квазистатика). Следовательно, величина ЕЛ характерна для каждой конкретной клеточной мембраны. Иными словами, она является ещё одной характеристикой биомембраны конкретного типа клеток, в дополнение к величине их поверхностного давления и определятся мембранной сжимаемостью (или эластичностью).

КВАЗИСТАТИКА и КВАЗИДИНАМИКА.

Введение этих терминов – условное деление одного и того же процесса. Мембрана является весьма динамичной структурой, все компоненты которой обладают той или иной степенью подвижности. Но, в ряде случаев можно не учитывать подвижность отдельных молекул или их частей в мембране. При этом рассматриваются большие (состоящие из множества молекул) системы и процессы, протекающие в них, происходят за время, которое гораздо больше, чем время, характерное для процессов, описывающих поведение отдельных молекул. Такие длительные процессы, при которых рассматривается некоторое усреднённое состояние биомембраны и названы квазистатикой. Один из таких процессов рассмотрен в предыдущей работе.

Квазидинамикой названы те процессы, когда рассматривается поведение отдельных молекул и уже нельзя пренебрегать происходящими в низ изменениями. Но при этом, можно пренебрегать аналогичными изменениями у окружающих молекул.

Такое деление является искусственным и введено для упрощения изложения данного материала. И как любое упрощение имеет границы своей применимости. Например, при переходе от одной системы к другой системе нужно помнить о различиях между энергией и свободной энергией.

Рассмотрим в качестве примера один из вариантов реакции мембранного белка на внешний раздражитель. Этот внешний раздражитель (назовём его сигналом), которым может быть некая другая молекула белка, квант света или что-нибудь ещё, должны вызывать ответ белка. Это может быть, к примеру, химическая реакция. Пусть это будет экзотермическая реакция (это не принципиально, а так проще для наглядности), т.е. в результате выделиться некоторая энергия. Это энергия идет на изменение структуры молекулы белка (его активацию) в элементарном акте реакции белка на раздражитель и создании ответа, т.е. на трансформацию сигнала. После чего нормальная белковая молекула возвращается в первоначальное состояние, т.е. происходит другой элементарный акт – возвращение молекулы белка из активированного состояния в исходное. Иначе, релаксация белка в исходное состояние. Нормальная белковая система в мембране – система много разового использования.

Самый простой вариант описанного выше процесса изображен на рис. 1. В ответ на внешний сигнал в молекуле белка происходит структурная перестройка, которая увеличивает диаметр молекулы – молекула переходит в активированное состояние (рис. 1А). Увеличение диаметра молекулы сопровождается работой против сил латерального сжатия мембраны. Таким образом, происходит переход энергии активации белка в энергию латерального сжатия окружающей его мембраны. Такая диссипация энергии приводит к нагреву мембраны (в классике этот процесс описывается уравнением PV = RT), а, следовательно, и клетки. Затем после завершения элементарного акта трансформации сигнала, белок под действием латерального давления мембраны возвращается в исходное состояние (рис. 1В). Аналогичных схем можно предложить ещё несколько, но для понимания принципа достаточно и этой.

КВАЗИЧАСТИЦЫ.

 

В первой работе данного сборника уже отмечалась важность упорядоченного состояния углеводородных цепей липидных молекул в мембранах (Метод определения…, и приведённые там ссылки). Показано, что в липидном бислое первые 7 – 8 углеродных атомов от поверхности мембраны углеводородных цепей фосфолипидных молекул обладают “дальним порядком”. По мере приближения к центру мембраны их упорядоченность резко падает практически до нуля.

Рассмотрим углеводородную область биомембраны. Полярные районы тоже важны, без них просто было бы невозможным квазидинамическое описание мембраны. Но сейчас важно, что полярные головки липидных молекул являются якорями для их углеводородных цепей. Таким образом, в квазидинамике можно рассматривать липидное окружение белковой молекулы в мембране как неподвижное, т.е. полярные головки молекул при “быстрых процессах” не успевают сменить свое местоположение.

При дальнейшем рассмотрении будут использованы основные понятия квантовой механики, особенно, молекулярной квантовой механики, физики твёрдого тела и квантовой акустики. Эти понятия изложены в различных монографиях, учебниках, посвящённых указанным выше вопросам.

В рамках представленной Молекулярно-механической модели бывает удобно рассматривать структуру липидного бислоя биомембраны в следующем виде:

Биологическую мембрану можно описать как липидный бислой, в котором плавают и/или пронизывают его мембранные белки. При этом степень упорядоченности углеводородных цепей липидных молекул бислоя сначала незначительно падает, а затем резко уменьшается по мере движения от поверхностей бислоя к его центру. Иными словами, имеем 2 тонких слоя на поверхностях бислоя, обладающих строением, похожим на строение твердого кристалла. В отличие от нормального кристалла, структура таких слоёв менее регулярна (в них больше дефектов) в каждый момент времени. В самом слое происходит постоянный обмен местами между отдельными компонентами слоя. Последний процесс обусловлен латеральной диффузией липидных молекул по поверхности бислоя. (В квазистатике это не существенно.)

Для квазидинамики уже существенно, что липидный бислой можно рассматривать как два квази твёрдых тела, разделённых (по аналогии) квазижидкостью, чем-то, что уже не является квази твёрдым телом. (Это ещё не все квази.) Эти квази твёрдые слои плотно охватывают мембранные белки. Так плотно, как это возможно на молекулярном уровне.

Из квантовой физики известно, что “механическое” воздействие в кристалле, включая и тепловое движение его частиц (узлов, атомов или молекул) передаётся с помощью квантовых квазичастиц – фотонов, которые и переносят энергию такого взаимодействия. Следовательно, в квазидинамике механическое взаимодействие белка с мембраной в процессе элементарно акта передачи сигнала, является процессом взаимного обмена фононами определённых энергий – частот.

Если посмотреть теперь на рис. 1В, то понятно, что чёрные треугольники являются квази динамиками, через который белок излучает добавочную энергию возбуждения при релаксации в исходное состояние, и эта энергия излучается в виде фонона. Фонон, в свою очередь, может рассеяться на дефектах квази твердого участка бислоя, а его энергия пойдёт на нагревание всей клетки. Ещё фонон может распространиться по квази твёрдому участку бислоя до следующей белковой мембранной системы (как отдельной молекулы, так и ансамбля различных молекул) и служить для неё внешним сигналом. На рис. 1А это будет выглядеть как появление ещё одного чёрного треугольника (но теперь приёмника фонона) у молекулы невозбуждённого белка. Стрелка “сигнал” сместится в мембрану так, что бы показывать на этот треугольник. Она может совпасть или быть близкой к стрелке “релаксация” на рис. 1В. Далее – по схеме.

В этом случае, центральная, не квази твёрдая область бислоя, разделяет два проводящих фононы приповерхностных участка мембраны. И роль этой центральной области – позволить двум сторонам мембраны функционировать независимо друг от друга (фононовый изолятор).

Таким образом, получается, что биологические мембраны можно рассматривать как квантовые системы, где процессы активации и дезактивации отдельных частей (белковых мембранных систем) могут осуществляться путём излучения или поглощения фононов. Сами мембраны характеризуются своими специфическими энергетическими уровнями (с точностью до kT), обусловленные их липидным составом и особенностями молекулярной структуры мембранных белковых систем.

Следовательно, фононные спектры в биологии могут играть ту же роль, что и фотонная спектроскопия в различных областях науки и техники при исследовании и идентификации различных химических соединений. Активируя или инактивируя те или иные системы в биологических мембранах, мы будем менять и их функционирование, то есть, воздействовать на свойства клеток и их состояние.

Многие аспекты традиционной оптической спектроскопии справедливы и для предлагаемой звуковой спектроскопии. Правда, надо учитывать, что фононы и фотоны отличаются не только одной буквой, но и относятся ещё и к разным типам квантовых частиц. Одни – Бозоны (Bosons), а другие – Фермионы (Fermions). Иначе, Бозе и Ферми частицы. (Bose- and Fermi-particles)

Данная работа завершает серию работ, где кратко изложены основные понятия, необходимые для понимания сути предлагаемых изобретений. Многие аспекты, не имеющие прямого отношения к патентуемым изобретениям, были сознательно опущены. Это сделано для простоты и краткости изложения. Однако. если будет интерес, тоя готов представить и некоторые другие материалы, например, связанные с распространением нервного импульса и механизмом действия алкоголя на организм, а так же и другие.

Мною показано существование фононных спектров, различных для разных клеток. Это, а также оборудование для фононной спектрометрии и являются сутью моего патента РСТ/CZ01 /00046 от 26.08.2001. Автор заинтересован в компаньонах, способных оказать помощь в реализации данного патента.

Фиг. 1A

Фиг. 2B

Пояснения даны в тексте.

Дата публикации: 8 сентября 2003
Источник: SciTecLibrary.ru

Вы можете оставить свой комментарий по этой статье или прочитать мнения других в следующих разделах ФОРУМА:
Свернуть Защита интеллектуальной собственности и авторских прав
Диспуты по темам изобретательства. Вопросы по изобретениям, проблемы на пути изобретателей и методы их решения.
Патентование. Все о патентовании изобретений, полезных моделей, промышленных образцов и товарных знаков.
Нерешенные задачи. Здесь идет обсуждение нерешенных задач: безопорный двигатель, вечный двигатель, преодоление гравитации и пр.
Свернуть Точные науки и дисциплины
Дебаты по Теории Относительности Эйнштейна. Все кому не лень хотят опровергнуть Теорию Относительности Эйнштейна. Вам предоставляется слово для аргументации.
Физика, астрономия, математические решения. Физико-математические вопросы, наблюдения, исследования, теории и их решение.
Физика альтернативная. Новые взгляды на физические законы, теории, эксперименты, не вписывающиеся в общепринятые законы физики.
Teхника, узлы, механизмы, электроника и аппаратура. Все про технику, приборы, детали, узлы и механизмы. Электроника, компьютеры, программное обеспечение. Новые технические решения в самых разных областях.
Биология, Генетика, Все о жизни. Генетика и другие вопросы биологии. Их развитие. Медицина. Биотехнологии, агротехника и сельское хозяйство. Эволюционные теории и альтернативные им.
Химия. Вопросы по химическим технологиям, разработкам и применению химических материалов. Химические элементы и их свойства.
Геология, все о Земле и ее обитателях. Геология, метеорология, антропология, сейсмология, атмосферные явления и непознанные эффекты природы.
Свернуть Мозговой штурм
Генератор решений. Здесь Вы можете заработать реальные деньги, помогая решать фирмам, предприятиям и частным лицам те или иные технические задачи, которые перед ними стоят. Те, кто ставят задачи перед участниками должны обозначить гонорар за ее решение и перевести указанную сумму на общий счет генератора.
Головоломки. Если у Вас есть желание поломать голову над интересными логическими задачами - Вам сюда.
Гипотезы. В этой теме идет обсуждение гипотез и предположений, основанных чисто на теории и логике.
Найди ляп! Этот раздел для тех, кто хочет мысленно расслабиться. Он посвящен задачам по поискам ляпов, которые встречаются в литературе, интернете, кино и на телевидении.
Свернуть Взгляд в будущее и настоящее
Глобальные темы. Вопросы касающиеся всех. Глобальные угрозы и злободневные темы современности.
Наука и ее развитие. Все о развитии науки, направлениях и перспективах движения научной мысли и знаний.
Новая Цивилизация. Принципы социального устройства новой цивилизации. Увеличение роли созидательного интеллекта... Отдалённые перспективы развития человечества...
Вопросы без ответов. Этот раздел посвящен вопросам и проблемам, которые до сих пор не решены. Предлагайте свои решения.
Военная стратегия и тактика современных боевых действий. Об особенностях современного военного искусства. Проблемные вопросы теории и практики подготовки вооруженных сил к войне, её планирование и ведение в различных конфликтах на планете.
Свернуть Гуманитарные науки и дисциплины
Философские дискуссии. Диспуты по вопросам жизни, сознания, бытия и иных философских понятий.
Экономика. Вопросы по экономике и о путях развития России и других стран.
Социология, Политология, Психология. В этом разделе обсуждаются вопросы, как отдельных частных исследований данных наук, так и проблема соотношения этих наук с остальными.
Образование. Все об образовании: как учить, кому учить, чему учить и кого учить.
Религия и атеизм. Вопросы религий и атеистические взгляды, религиозные споры.

Хотите разместить свою статью или публикацию, чтобы ее читали все?
Как это сделать - узнайте здесь.

Назад

 
О проекте Контакты Архив старого сайта

Copyright © SciTecLibrary © 2000-2017

Агентство научно-технической информации Научно-техническая библиотека SciTecLibrary. Свид. ФС77-20137 от 23.11.2004.